電泳技術

（electrophoresis）電泳技術

（electrophoresis）1本章主要內容基本原理醋酸纖維薄膜電泳(CAME)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS電泳瓊脂糖凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳本章主要內容基本原理2概念帶電粒子在直流電場中的作用下，在一定介質（溶劑）中發生的向異性電極定向移動的現象稱為“電泳”利用電泳現象對混合物進行分離分析的技術稱為“電泳技術”概念帶電粒子在直流電場中的作用下，在一定介質（溶3分類按有無支持物分為：自由電泳，區帶電泳（其中根據支持物的不同而有不同的名稱如紙電泳，瓊脂糖電泳等）按電壓分：低壓電泳，高壓電泳按用途分：分析電泳，制備電泳，定量免疫電泳按支持物形狀分：薄層電泳，平板電泳，圓盤電泳，毛細管電泳按區帶形式分：盤狀電泳，火箭電泳分類按有無支持物分為：自由電泳，區帶電泳（其中4特點凡是帶電物質均可應用某一電泳技術分離，并可進行定性定量分析樣品用量少設備簡單可在常溫進行操作簡便省時分辨率高特點凡是帶電物質均可應用某一電泳技術分離，并可進5蛋白質電荷的來源蛋白質電荷的來源6電泳的基本原理帶電粒子在電場中所受的力F=QE所受阻力F’=6πrηv電泳平衡時F=F’，則QE=6πrηv遷移率(電泳淌度)＝Q/6πrη,表示粒子在單位電場強度下的泳動速度不同物質能否利用電泳進行分離，決定于兩者遷移率的差別，有差別才能分離。電泳后分開的距離與遷移率、電壓、時間等相關電泳的基本原理帶電粒子在電場中所受的力F=QE7影響電泳的因素樣品的性質電場強度緩沖液：(1)pH值

(2)成分

(3)離子強度支持介質：吸附、電滲，分子篩溫度影響電泳的因素樣品的性質8電滲

（electro-osmosis）在電場作用下液體相對于固體表面的移動稱“電滲”電滲

（electro-osmosis）在電場作用9醋酸纖維薄膜電泳

（celluloseacetatemembraneelectrophoresis,CAME）醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯對蛋白質樣本吸附少，分離速度快，時間短，電滲作用雖然高但很均一，不影響分離效果，經透明化處理后有利于光吸收掃描測定和膜的長期保存影響因素：膜的性質，緩沖液，電流和電壓，電泳時間和溫度，電泳槽的密封性能醋酸纖維薄膜電泳

（celluloseacetatem10聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacryamidegelelectrophoresis,PAGE）

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide,Acr）和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,Bis）在加速劑（TEMED）和催化劑（硫酸銨）的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacryamidegele11聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應12聚丙烯酰胺凝膠特點：(1)在一定濃度時，凝膠透明、有彈性、機械性能好(2)化學性能穩定，與被分離物不起化學反應(3)對pH和溫度變化較穩定(4)幾乎無電滲作用,只要Acr純度高，操作條件一致，則重復性好(5)樣品不易擴散且用量少(6)凝膠孔徑可調節(7)分辨率高聚丙烯酰胺凝膠特點：(1)在一定濃度時，凝膠透明、有彈性、機13凝膠聚合的影響因素空氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，故聚合過程中反應液應與空氣隔絕某些材料如有機玻璃等能抑制聚合反應某些化學藥物如赤血鹽等可減慢反應速度溫度升高聚合加快，溫度降低聚合減慢凝膠聚合的影響因素空氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，故聚14聚丙烯酰胺凝膠的性質總濃度T%：100ml凝膠中含有Acr和Bis的總克數T％越大，平均孔徑越小，凝膠機械強度增加。但達15％時膠脆性增大，易斷裂；T％過小則凝膠稀軟不易操作交聯度C%：交聯劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分數T%值固定時，C％＝5％時孔徑最小，高于或低于5％時孔徑相應變大。C%過大膠不透明，缺乏彈性；過小則凝膠呈糊狀聚丙烯酰胺凝膠的性質總濃度T%：100ml凝膠中含有Acr和15分子量范圍與凝膠濃度的關系分子量范圍與凝膠濃度的關系16PAGE的分類根據具體操作分為：圓柱型，平板型（水平方向、垂直方向）根據凝膠系統的均勻性分為：連續系統，不連續系統PAGE的分類根據具體操作分為：圓柱型，平板型（水平方向、垂17PAGE圓盤電泳示意圖PAGE圓盤電泳示意圖18不連續圓盤電泳示意圖不連續圓盤電泳示意圖19不連續電泳的物理效應樣品濃縮效應：凝膠孔徑不連續緩沖液離子成分不連續

pH的不連續性分子篩效應電荷效應各種蛋白質因所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同而得以分離不連續電泳的物理效應樣品濃縮效應：凝膠孔徑不連續20PAGE常見問題凝膠不聚合或聚合時間過長：最常見原因是硫酸銨失效，需新鮮配制；室溫較低時聚合變慢，可調整硫酸銨和TEMED用量指示劑向相反方向移動:電源連接錯誤，緩沖液選擇錯誤指示劑前沿呈“曲線”：“微笑”現象由凝膠冷卻不均勻造成；“皺眉”現象多由電泳裝置不合適、底部氣泡或靠近玻片的凝膠聚合不完全引起PAGE常見問題凝膠不聚合或聚合時間過長：最常見原因是硫酸銨21聚丙烯酰胺凝膠電泳課件22SDSSDS：十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate），陰離子去垢劑SDS帶有大量負電荷，大大超過天然蛋白質原有的電荷量，從而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間的電荷差異SDS作為變性劑和助溶劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構SDS-蛋白質的遷移率取決于分子量的大小SDSSDS：十二烷基硫酸鈉（sodiumdod23SDS-蛋白質復合物的形狀SDS-蛋白質復合物的形狀24瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的鏈狀多糖優點：(1)含液體量大，達98％～99％，近似自由電泳，但樣品擴散速度小，對蛋白質吸附極少(2)分辨率高,重復性好(3)電泳速度快(4)透明,不吸收紫外線，可直接用紫外檢測儀測定(5)區帶可染色，樣品易回收缺點：含有較多硫酸根，電滲作用大用途：用于核酸的分離、鑒定瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的鏈狀多糖25等電聚焦電泳

（isoelectricfocusingelectrophoresis,IEFE）利用具有線性pH梯度的電泳介質來分離等電點不同的蛋白質當蛋白質遷移至其pI相同的pH處，則不再泳動，而濃縮成狹窄的區帶蛋白質因其等電點的不同而得以分離等電聚焦電泳

（isoelectricfocusinge26pH梯度的形成pH梯度的形成27IEFE的聚焦效應IEFE的聚焦效應28常規PAGE與SDS的區別常規PAGE與SDS的區別29IEFE優缺點優點:(1)分辨率高,可將pI相差0.01～0.02pH單位的蛋白質分開(2)區帶狹窄(3)樣品不管加到什么部位都可聚焦到其等電點缺點:(1)需用無鹽溶液，而無鹽溶液中蛋白質易沉淀(2)不適于在pI點不溶解或發生變性的蛋白質IEFE優缺點優點:(1)分辨率高,可將pI相差0.01～030雙向電泳又稱二維凝膠電泳第一相為IEFE，根據蛋白質電荷差異進行分離第二相為SDS，根據蛋白質分子量差異進行分離分辨率極高，是蛋白質組研究的關鍵開門技術雙向電泳又稱二維凝膠電泳31聚丙烯酰胺凝膠電泳課件32轉移電泳轉移電泳33其它電泳技術脈沖場凝膠電泳毛細管電泳等等其它電泳技術脈沖場凝膠電泳34完！聚丙烯酰胺凝膠電泳課件35電泳技術

（electrophoresis）電泳技術

（electrophoresis）36本章主要內容基本原理醋酸纖維薄膜電泳(CAME)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS電泳瓊脂糖凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳本章主要內容基本原理37概念帶電粒子在直流電場中的作用下，在一定介質（溶劑）中發生的向異性電極定向移動的現象稱為“電泳”利用電泳現象對混合物進行分離分析的技術稱為“電泳技術”概念帶電粒子在直流電場中的作用下，在一定介質（溶38分類按有無支持物分為：自由電泳，區帶電泳（其中根據支持物的不同而有不同的名稱如紙電泳，瓊脂糖電泳等）按電壓分：低壓電泳，高壓電泳按用途分：分析電泳，制備電泳，定量免疫電泳按支持物形狀分：薄層電泳，平板電泳，圓盤電泳，毛細管電泳按區帶形式分：盤狀電泳，火箭電泳分類按有無支持物分為：自由電泳，區帶電泳（其中39特點凡是帶電物質均可應用某一電泳技術分離，并可進行定性定量分析樣品用量少設備簡單可在常溫進行操作簡便省時分辨率高特點凡是帶電物質均可應用某一電泳技術分離，并可進40蛋白質電荷的來源蛋白質電荷的來源41電泳的基本原理帶電粒子在電場中所受的力F=QE所受阻力F’=6πrηv電泳平衡時F=F’，則QE=6πrηv遷移率(電泳淌度)＝Q/6πrη,表示粒子在單位電場強度下的泳動速度不同物質能否利用電泳進行分離，決定于兩者遷移率的差別，有差別才能分離。電泳后分開的距離與遷移率、電壓、時間等相關電泳的基本原理帶電粒子在電場中所受的力F=QE42影響電泳的因素樣品的性質電場強度緩沖液：(1)pH值

(2)成分

(3)離子強度支持介質：吸附、電滲，分子篩溫度影響電泳的因素樣品的性質43電滲

（electro-osmosis）在電場作用下液體相對于固體表面的移動稱“電滲”電滲

（electro-osmosis）在電場作用44醋酸纖維薄膜電泳

（celluloseacetatemembraneelectrophoresis,CAME）醋酸纖維素是纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯對蛋白質樣本吸附少，分離速度快，時間短，電滲作用雖然高但很均一，不影響分離效果，經透明化處理后有利于光吸收掃描測定和膜的長期保存影響因素：膜的性質，緩沖液，電流和電壓，電泳時間和溫度，電泳槽的密封性能醋酸纖維薄膜電泳

（celluloseacetatem45聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacryamidegelelectrophoresis,PAGE）

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide,Acr）和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,Bis）在加速劑（TEMED）和催化劑（硫酸銨）的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacryamidegele46聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應聚丙烯酰胺凝膠的聚合反應47聚丙烯酰胺凝膠特點：(1)在一定濃度時，凝膠透明、有彈性、機械性能好(2)化學性能穩定，與被分離物不起化學反應(3)對pH和溫度變化較穩定(4)幾乎無電滲作用,只要Acr純度高，操作條件一致，則重復性好(5)樣品不易擴散且用量少(6)凝膠孔徑可調節(7)分辨率高聚丙烯酰胺凝膠特點：(1)在一定濃度時，凝膠透明、有彈性、機48凝膠聚合的影響因素空氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，故聚合過程中反應液應與空氣隔絕某些材料如有機玻璃等能抑制聚合反應某些化學藥物如赤血鹽等可減慢反應速度溫度升高聚合加快，溫度降低聚合減慢凝膠聚合的影響因素空氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，故聚49聚丙烯酰胺凝膠的性質總濃度T%：100ml凝膠中含有Acr和Bis的總克數T％越大，平均孔徑越小，凝膠機械強度增加。但達15％時膠脆性增大，易斷裂；T％過小則凝膠稀軟不易操作交聯度C%：交聯劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分數T%值固定時，C％＝5％時孔徑最小，高于或低于5％時孔徑相應變大。C%過大膠不透明，缺乏彈性；過小則凝膠呈糊狀聚丙烯酰胺凝膠的性質總濃度T%：100ml凝膠中含有Acr和50分子量范圍與凝膠濃度的關系分子量范圍與凝膠濃度的關系51PAGE的分類根據具體操作分為：圓柱型，平板型（水平方向、垂直方向）根據凝膠系統的均勻性分為：連續系統，不連續系統PAGE的分類根據具體操作分為：圓柱型，平板型（水平方向、垂52PAGE圓盤電泳示意圖PAGE圓盤電泳示意圖53不連續圓盤電泳示意圖不連續圓盤電泳示意圖54不連續電泳的物理效應樣品濃縮效應：凝膠孔徑不連續緩沖液離子成分不連續

pH的不連續性分子篩效應電荷效應各種蛋白質因所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同而得以分離不連續電泳的物理效應樣品濃縮效應：凝膠孔徑不連續55PAGE常見問題凝膠不聚合或聚合時間過長：最常見原因是硫酸銨失效，需新鮮配制；室溫較低時聚合變慢，可調整硫酸銨和TEMED用量指示劑向相反方向移動:電源連接錯誤，緩沖液選擇錯誤指示劑前沿呈“曲線”：“微笑”現象由凝膠冷卻不均勻造成；“皺眉”現象多由電泳裝置不合適、底部氣泡或靠近玻片的凝膠聚合不完全引起PAGE常見問題凝膠不聚合或聚合時間過長：最常見原因是硫酸銨56聚丙烯酰胺凝膠電泳課件57SDSSDS：十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate），陰離子去垢劑SDS帶有大量負電荷，大大超過天然蛋白質原有的電荷量，從而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間的電荷差異SDS作為變性劑和助溶劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構SDS-蛋白質的遷移率取決于分子量的大小SDSSDS：十二烷基硫酸鈉（sodiumdod58SDS-蛋白質復合物的形狀SDS-蛋白質復合物的形狀59瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的鏈狀多糖優點：(1)含液體量大，達98％～99％，近似自由電泳，但樣品擴散速度小，對蛋白質吸附極少(2)分辨率高,重復性好(3)電泳速度快(4)