關于特殊顯微鏡結構及操作技術第1頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五【實驗用品】1．試劑：10μg/mL羅丹明123的磷酸緩沖液（PBS）熒光染料。2．器材：倒置顯微鏡，相差顯微鏡附件（相差物鏡、轉盤聚光器、對中環形光闌和綠色濾色鏡等），微分干涉顯微鏡附件（起偏鏡、檢偏鏡和渥拉斯頓棱鏡等），熒光顯微鏡附件（熒光發射器、激發濾片和阻斷濾片等），載玻片，蓋玻片，牙簽，濾紙條，擦鏡紙，鑷子，滴管。第2頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五【實驗原理和方法】倒置顯微鏡是一種用于生物組織細胞離體培養觀察的光學顯微裝置，能直接對培養皿、培養瓶的標本進行顯微觀察。由于它的物鏡、物體和光源位置剛好與立式顯微鏡顛倒，被稱為倒置顯微鏡。倒置顯微鏡的物鏡在下，聚光器在上，被觀察樣品置于位于上方的聚光器之下，聚光器具有遠大于物鏡的工作距離。因此，適應于培養皿或培養瓶中樣品的觀察。高檔倒置顯微鏡可根據不同觀察要求，增加相差、微分干涉反差物鏡或熒光發射裝置，構建成相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡或熒光顯微鏡。第3頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五一、倒置顯微鏡的構造與使用（一）倒置顯微鏡的構造倒置顯微鏡由目鏡、透射照明器、聚光器、載物臺、物鏡和顯微鏡機體等部件構成，以TE2000-U顯微鏡為例介紹。TE2000-U顯微鏡配有：T-DH100W透射照明器、LHS-H100P-112V100W燈室、12V100W鹵素燈、TE2-PS100W電源、T-SR矩形載物臺、T-TD雙目鏡筒D、CFI10X目鏡、T-N6六孔物鏡轉換器，系統聚光器、物鏡、電源線等。第4頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第5頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五1.目鏡筒及目鏡A:屈光度調節環B:目鏡C:目鏡筒轉盤O:開B:勃氏鏡(帶有聚焦螺釘)C:關(光閘)M:2.5倍放大第6頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五2.顯微鏡機體第7頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五3.透射照明器:透射照明器必須根據規定使用燈泡(12V100W或6V30W)。T-DH100W透射照明器需燈室。A：視場光闌調節桿B：濾色片滑片C：聚光器再聚焦制動器D：聚光器調焦旋鈕E：聚光器固定螺釘F：聚光器安裝定位孔G：聚光器安裝定位槽H：聚光器轉動指緊螺釘I：聚光器調中螺釘J：聚光器安裝(可轉動)支架K：LHS-H100P-112V100W燈室L：燈室固定螺釘M：燈室蓋指緊螺釘N：聚光器支架(可移動)O：聚光器支架指緊螺釘P：燈室線Q：聚光器支架下降定位螺釘第8頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第9頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五T-DS30W透射照明器A：防塵滑片(可移動)B：F堵口滑片(可移動)C：聚光器安裝支架D：6V30W燈室E：濾色片滑片F：安裝附加裝置M4螺紋孔第10頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五系統聚光器T-DH100W透射照明器A：聚光器孔徑光闌B：聚光器模塊C：聚光器模塊固定螺釘D：聚光鏡(有三種可選：ELWD、LWD、HMC)E：環形光闌調中螺釘(僅用于相差模塊中)第11頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五T-DS30W透射照明器(霍夫曼觀察)

第12頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五ELWD-S聚光器A：調中桿指緊螺釘B：調中桿C：轉盤第13頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五SLWD聚光器第14頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五T-SR矩形載物臺A：載物環灣B：載物臺Y軸方向移動控制旋鈕

C：載物臺X軸方向移動控制旋鈕第15頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五（二）由TE2000-U，100W透射照明器，系統聚光器，以及T-TD目鏡筒D組成的顯微鏡系統。

明視場(BF)鏡檢關鍵點：從光路中卸下其它形式觀察需要的所有光學組件，聚光器調節好（調節聚焦和對中），轉動孔徑光闌調節好像的清晰度。第16頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五1.復位1）逆時針轉動，松開透射照明器中的“聚光器再聚焦指緊螺釘”。2）把“目鏡筒轉盤”設置到＜O＞位。3）把顯微鏡右側的“中間放大倍數刻度盤”打到＜1X＞。4）逆時針轉動，松開顯微鏡右側粗∕微調旋鈕后面的“物鏡再聚焦定位環”第17頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第18頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五2.打開透射照明器1）把電源后部的“外部開關”打到開的位置；2）把電源“電源開關”打開。(把開關撥至│)；3）按下顯微鏡左側的“照明器開關”接通燈泡。第19頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第20頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五3.調節燈泡亮度保證色彩真實。1）把顯微鏡左側的“亮度調節盤”設置成＜12V100W＞；2）把透射照明器中的“NCB11濾色片”插入光路中；3）把透射照明器中的“ND4濾色片”插入光路中。第21頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五4.調節光路1）把10X物鏡轉到光路中。2）把顯微鏡右側的“光路轉換盤”轉到＜1＞的位置。（100%光到觀察口）3）向上推透射照明器上的“視場光闌桿”完全打開視場光闌。4）將系統聚光器上的“孔徑光闌桿”轉至右側極限處把“孔徑光闌”完全打開。5）轉動聚光器調焦旋鈕把聚光器調至最低位置。第22頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第23頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五5.明視場觀察時對顯微鏡的調整把“聚光器轉盤”轉到＜A＞位置。第24頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五6．調節視度及瞳距1）將顯微鏡前部的“攝影取景框轉盤”逆時針旋轉，使攝影取景框進入光路。2）用左眼對著左側目鏡，轉動目鏡“屈光度調節環”，使取景框中的雙十字線清晰成像。3）用右眼對著右側目鏡，轉動目鏡“屈光度調節環”，使取景框中的雙十字線清晰成像。4）將顯微鏡前部的“攝影取景框轉盤”順時針旋轉，使其退出光路。5）調節目鏡瞳距，將兩目鏡視場所見的影像重合在一起。第25頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第26頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五7.調焦1）將樣品放置載物臺中。2）轉動同軸粗微調旋鈕，將標本對好焦。第27頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五8.聚光器中心調節1）確信10X物鏡在光路中。2）將“視場光闌調節桿”降低直到能從目鏡看到視場光闌像。3）轉動“聚光器調焦鈕”升降聚光器，使視場光闌像清晰地成象在標本面上。4）轉動兩個“聚光器中心調節螺釘”，使視場光闌像在視場中心。5）更換40X物鏡。6）調節“視場光闌調節桿”，使視場光闌的象與視場大致相同。7）轉動兩個“聚光器中心調節螺釘”，使視場光闌像在視場正中。第28頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第29頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五9.進行觀察1）選擇要使用的物鏡2）移動系統聚光器上的“孔徑光闌調節桿”，使孔徑為物鏡數值孔徑的70－80%。（“把目鏡筒轉盤”設到＜B＞位置，轉動勃氏鏡調焦螺釘使其聚焦，當觀察到物鏡的出瞳和孔徑光欄的象時，調節其大小。）3）調節“視場光闌調節桿”使視場光闌像與視場相大致相同。4）把透射照明器里的“ND減光片”進入或退出光路以調節視場亮度。第30頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第31頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五10.更換樣品利用顯微鏡主體上的“物鏡再聚焦定位環”，照明器上的“傾斜裝置”，“聚光器再聚焦指緊螺釘，可容易更換樣品。第32頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五11.顯微鏡操作結束后1)關閉電源開關(開關撥至O)2)燈室冷卻后，把顯微鏡上的聚乙烯防塵罩蓋好。第33頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五相差（PH）顯微術觀察透明細胞或其他透明樣品，需配相襯聚光器、相襯物鏡、相襯環等附件。相襯板將衍射光推遲1/4波長，振幅相減，樣品暗，背景亮，稱正反差或暗反差，分正低（DL）、正低低（DLL）和中型暗相差（DM）。折光率較強的樣品用后者。相襯板將直射光推遲1/4波長，振幅相加，樣品亮，背景暗，稱負反差或明反差，分負中（NM）和負高（NH）。折光率較小的樣品用后者。第34頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五關鍵點：將有ph標記的物鏡與物鏡相同ph標記的聚光器模塊一起送入光路，在進行顯微術前，校正(對中)物鏡里的相差板及聚光器模塊里的環形光闌。第35頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五1.用明視場（BF）顯微術對樣品聚焦。

2.相差觀察時對顯微鏡的調整。1)將ph物鏡轉入光路。2)轉動“聚光器轉盤”，使其與在光路中的物鏡(步驟1中所安置的)具有相同的ph標記。3)向右轉動聚光器上的“孔徑光闌調節桿”，完全打開孔徑光闌。第36頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第37頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五3.對中環形光闌1)把“目鏡筒轉盤”設到<B>位置，轉動勃氏鏡聚焦螺釘，使環形光闌像清晰。2)用六角起子轉動聚光器模塊中的兩個“環形光闌對中螺釘”，使環形光闌像與物鏡中的相差板環形像同心。3)把目鏡筒轉盤位置再轉到<O>上。調中心手輪第38頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第39頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五4.進行觀察1)把聚光器“孔徑光闌”完全打開。2)移動透射照明器上的“視場光闌調節桿”，使視場光闌像大小與視場大小接近。3)把透射照明器上的“NCB11濾色片”從光路中移開，把“GIF濾色片”移進光路。(提高反差)4)可通過把“ND濾色片”移進或移出光路來調節視場亮度。第40頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五第41頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五5.使用不同放大倍數的物鏡進行觀察1)把所需放大倍數的相差物鏡移入光路。2)轉動“聚光器轉盤”，使其與在光路上物鏡（步驟1中所安置的）具有相同的ph標記。3)調節放入光路中的環形光闌中心。(見程序3)第42頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五6.更換樣品利用使用顯微鏡主機上的“物鏡再聚焦定位環”，透射照明器上的“傾斜”裝置及“聚光器再聚焦指緊螺釘”，可容易更換樣品。7.顯微鏡操作結束后與明視場顯微術步驟相同。第43頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五微分干涉（DIC）顯微術可觀察到樣品的立體感，適用于顯微操縱等，彩色圖像。因塑料培養皿的不均衡張力在DIC下呈現干涉條紋、DIC不宜用于普遍使用的塑料培養皿。DIC的光通亮大，可用到100倍物鏡。需配DIC聚光器等附件，使用明場物鏡。1．用明場找到視野2．壓入起偏器，選擇相應模塊3．調節孔徑光柵至最佳效果。第44頁，共48頁，2022年，5月20日，8點2分，星期五熒光（E）顯微術適用于本身屬于或被染色后形成熒光體的樣品。熒光體在一定波長光（紫外或可見）的激發下發光（即熒光，波長長于激發光）。需配熒光附件和濾光器等。前者主件為激發光源，一般分汞燈系統和鹵燈系統，汞燈既適用于紫外光激發也適用于可見光激發，且能量較高；后者只適用于可見光激發。（此處插入拍攝圖片）第45頁，共48頁，202