第六章免疫電鏡常規電鏡：形態結構免疫學方法：組分免疫電鏡：形態結構+組分免疫電鏡延伸了免疫光鏡1010203概況三點擊此處輸入相關文本內容整體概況概況一點擊此處輸入相關文本內容概況二點擊此處輸入相關文本內容2細菌，冰凍超薄切片，免疫標記腺苷酸環化酶，醋酸鈾染色34雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm5免疫電鏡要解決的兩個問題免疫電鏡標本的結構保存與抗原活性保存問題——二者經常矛盾在電鏡下顯示抗體的合適的標記物6ξ1低溫包埋超薄切片法制備免疫電鏡標本1取材與固定

[目的]將所取樣本盡可能固定在生活狀態下，并保存樣本的抗原活性7固定劑好不用鋨酸不用或少用GA常用好FA抗原活性保存結構保存8固定液4%FA(in0.1MPB)或4%FA+0.01~0.5%GA(in0.1MPB)免疫光鏡預實驗9取材FA+GA固定液中4°C2~3h(中間1-2h可取出修塊)封閉游離醛基（0.5MNH4Clin0.1MPB）4°C2h沖洗（0.18M蔗糖in0.1MPB）4°C2h或過夜中間換液2~3次*常規電鏡標本可在沖洗液中存放1~2周，但免疫電鏡標本不行，因為GA濃度很低微細結構變化大102脫水30%50%70%90%100%100%30m60m60m60m60m60m0°C冰水中加些鹽-20°C低溫冰箱-20~-40°C-20~-40°C-20~-40°C-20~-40°C[目的]去除樣品中的水，為包埋劑（水溶性）的均勻浸透做準備脫水劑：乙醇，甲醇，異丙醇，乙醚，或丙酮（梯度脫水）11脫水劑對抗元的滅活作用隨溫度降低，但不能低到脫水劑結冰的溫度，所以應選擇結冰溫度低的脫水劑預先冷卻好全部用具123浸透與包埋[目的]使包埋劑浸透樣品后，固化成硬塊13包埋劑（幾類物質的混合物）羥丙基甲基丙烯酸酯（基本成分）乙二醇丙烯酸酯（交連固化劑）苯甲酸烷基乙醚（激活劑）LowicrylK4M(德國)LRWhite(英國)低溫（-20~-40°C),紫外光照射下,自由基鏈式反應14常規與免疫電鏡包埋劑比較化學活性親水性固化條件15稱量要準確，尤其量少的膠拌時避免產生氣泡（O2自由基聚合阻聚劑）使用無色透明膠囊（無色明膠或聚酯膠囊）包埋劑加滿加蓋用具全部預先冷卻注意事項1617紫外照射聚合箱30~40cm紫外燈：波長360-365nm，N=12W-20~-40°C,24h,RT2-3d保存：干燥器（-20°C）可保存很長時間，取出時連同干燥器一同移至室溫下，達到室溫后再拿出184切片親水性包埋劑切片與非親水性包埋劑切片技術要領上有所不同切片存放195免疫標記（略）206免疫標記后染色1.8%醋酸鈾+0.2%甲基纖維素,RT,5m*不宜長時間沖洗（控制在5~10s），易脫色*任何一步都不能讓載網干21ξ2冰凍超薄切片法制備免疫電鏡標本[特點]：簡便，快，抗原活性保存好結構保存相對差，價格貴221取材與固定[固定目的]將各種組分盡可能固定在生活狀態下，醛固定后蔗糖可滲透細胞FA(2~4%)+GA(0.01~0.5%)固定液中4°C2~3h(中間1-2h可取出修塊)沖洗（0.18M蔗糖in0.1MPB）4°C2h或過夜，中間換液2~3次23*固定時間越長，結構保存越好，抗原活性保存越差*對于可溶性的物質（細胞溶質，分泌蛋白）需加GA以避免免疫反應過程中可溶性的物質被抽提*對于膜或細胞骨架上的物質而言，可溶性物質的被抽提有利于膜或細胞骨架上物質的接觸免疫標記物242冷凍保護將標本塊轉移到蔗糖（2.3Min0.1MPB）溶液中，不少于30m253冷凍將標本塊固定到樣品架上，并一同在液氮中冷凍，然后將樣品架迅速轉移到冷凍切片室中（-90~-110°C）264冰凍超薄切片在冰凍超薄切片機上進行*玻璃刀，鉆石刀27粗0.2mm不銹鋼絲，園環直徑~2mm蔗糖2.3Min0.1MPB

280.5μm,半薄切片相差顯微鏡50~100nm,超薄切片292%明膠(in0.1MPB)吸走蔗糖,減少背景等待免疫標記（存幾個小時）切片存放明膠濕室30免疫標記過程中，切片面浸濕，載網背面干燥載網浮在液滴上5免疫標記316免疫標記后染色染色液：4%醋酸鈾+0.3M草酸（與醋酸鈾等體積），用5%NH4OH調pH至7~7.5RT,5m327甲基纖維素包埋[目的]:防治干燥時產生皺縮2%甲基纖維素水溶液+2~4%醋酸鈾（使醋酸鈾最后的濃度為0.1~0.4%）10m用不銹鋼環撈出，濾紙吸水，干燥33所形成甲基纖維素的最終厚度與結構保存和圖像反差關系密切，干涉色呈金色，藍色適宜厚，結構保存好，犧牲圖像反差薄，圖像反差好，留下干燥帶來的違跡厚度取決于移走的甲基纖維素溶液量34ξ3

電鏡下顯示抗體的標記物—膠體金

35熱力學穩定熱力學穩定熱力學不穩定溶液（均相）沉淀（異相）溶膠（異相）1膠體（金）概念及性質36溶膠的重要特征：微小的顆粒，顆粒越大越不穩定膠體金：1~100nm(<80nm紅，80nm蘭)制備：工業實驗室HAuCl4+（單寧酸+檸檬酸鈉）

Au可制備各種設定尺寸的膠體金，顆粒均勻現代免疫化學標記技術，李成文37膠體金的優點結合原理為物理吸附重金屬，圖像反差好顆粒均勻，圓球形狀，易于辨認做成不同大小的尺寸，可進行雙標記可同時用于免疫透鏡，免疫掃描電鏡38膠體性質吸附離子而帶電吸附大分子物質（物理）膠體沉聚（在膠體金中加入一定量的電解質如NaCl,馬上可以看到膠體金的沉聚現象-由紅色變成藍色，放置一段時間或超速離心后在試管底部得到藍色沉淀）膠體保護（在膠體金中加入一定量的親水大分子可使溶膠變得穩定，再加NaCl時不再出現沉聚現象）392膠體金-抗體復合物制備抗體蛋白不含或只含極少電解質IgG(1mg/ml)/四硼酸鈉（2mMpH=9）4°C，20h,中間換液3~4次?40最適pH：在接近或略高于抗體的等電點時復合物最穩定（高0.1~0.2pH）查抗體的等電點IgG，最適pH=9.0~9.2PA,最適pH=5.9~6.2一般抗體pH在透析時調好膠體金pH用稀酸堿調（0.1MHCl,0.2MKCO3）*pH測定：重金屬會阻塞電極，用pH紙或先在膠體金中加入2~3滴1%乙二醇（Mw20,000）后在測41最適蛋白量：12345678水0ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml抗體0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml抗體濃度11/21/41/81/161/321/641/128膠體金0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5mlNaCl0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml42最小蛋白量：找到膠體金顏色（紅）剛開始變化（紫）的試管，其前一管為最小蛋白量最適蛋白量：（１＋１０％）最小蛋白量？＊分子量小的抗體應事先與非特異蛋白（如ＢSA）偶聯后才能吸附到膠體金表面43IgG-膠體金復合物制備將IgG溶于雙蒸水內，濃度1mg/ml對2mM/四硼酸鈉緩沖液（pH=9）透析，4°C，20h,中間換液3~4次離心，100,000g，4°C，1h，取上清調膠體金pH=9確定IgG與膠體金結合的最適蛋白量按最適蛋白量混合IgG與膠體金，再加10%BSA1ml,輕輕混勻離心，4°C，45m，離心力大小由膠體金尺寸大小決定（15nm,60,000g，5nm,125,000g棄上清，將沉淀溶于1ml20mMTris緩沖液中（pH=8.2，內含1%BSA）44ξ4免疫電鏡實驗設計包埋前法：先免疫標記，后制備超薄切片（適用于抗原暴露在外的情況，如膜外周蛋白）,超薄切片可按常規電鏡標本制備技術進行包埋后法：先制備超薄切片，后免疫標記（適用于細胞內抗原)，超薄切片技術需按免疫電鏡標本制備技術進行45親和標記：抗原——抗體激素——受體糖基——植物凝集素免疫標記：一抗標記法，二抗標記法，

PA法，PG法，其它分子橋技術（如生物素與抗生素蛋白）46包埋后法的免疫標記程序[0.02M甘氨酸（in0.1MPB），10m(3*3)0.1MPB(含1%BSA),RT5m一抗[in0.1MPB(含1%BSA),],RT,1-2h或4°C過夜漂洗，0.1MPB，10m(3*3)二抗-膠體金，RT,1-2h漂洗，0.1MPB，10m(3*3)漂洗，dd