1、第四部分 A280/A260法測定蛋白質濃度目前在生物化學實驗中有幾種測定蛋白質濃度的方法：280nm/260nm（A280/A260）光吸收法，Bradford檢測法，Lowry檢測法和二喹啉甲酸（BCA）檢測法，通常根據蛋白質樣品量大小，蛋白純度等因素選擇不同的測定方法。本實驗只需對層析洗脫峰進行快速而粗略的定量分析，因此選擇A280/A260光吸收法。一、原理由于蛋白質分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環結構的氨基酸，在紫外280nm波長處有最大吸收峰，其吸收值與蛋白質濃度成正比，故可用波長吸收值大小來測定蛋白質含量，但由于此方法無法排除核酸的干擾，因而在通常情況下還要測定樣品在2

2、60nm處的OD值（光吸收值）。二、提要1. 所需時間：幾分鐘2. 優點：方便、快速，且對蛋白質無破壞性，測定后的蛋白質仍能回收利用。3. 缺點： 1）準確度較差，不是嚴格的定量，因為此法是根據酪氨酸（Tyr），苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）殘疾的強吸收值來測定的。不同蛋白質有不同的消光系數，如果一種蛋白質中沒有上述三 種氨基酸殘基，用此法則不能檢出。 2）核酸可引起強干擾作用4.靈敏度：0.05mg/ml2mg/ml；比色杯的最小測量體積為0.1ml三、設備和試劑1. 設備1）紫外可見分光光度計；2）石英比色杯；3）濾紙；4）擦鏡紙；5）用于溶液轉移的吸管或移液槍2. 試劑實驗用緩沖液

3、四、操作步驟將實驗緩沖液加入比色杯中，將A280（或A260）值調零，再吸去緩沖液對照加入樣品，記錄A280和A260值；三次求平均值。五、注意事項1. 實驗室中常犯的錯誤是認為用1cm的比色杯所測吸收值為1.0時，蛋白質濃度大約為1mg/ml，這是非常不精確的；2. 玻璃和塑料在紫外吸收光范圍內本身就具有光吸收值，因而不能用來進行蛋白質的定量如果所測值超過測量范圍（A280示數顯示在0.12.0為宜），應將樣品用緩沖液稀釋后再測量。3. 如果實驗所用的緩沖液和水相比有較高的光吸收值，這說明緩沖液有干擾物質存在。4. 修改測定方法可部分改正由于干擾物質和蛋白質組成不同所引起的誤差，最常用的是檢

4、測A280/A260的比值，通常： 純蛋白質的光吸收A280/A260值為 1.8 純核酸的光吸收A280/A260值為 0.5蛋白質溶液的A280/A260值如為2.0，這時可忽略溶液中核酸的光吸收值，否則視為含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其A280和A260，再用以下經驗公式，即可計算出蛋白質的濃度： 蛋白質濃度（mg/ml）= 1.5×A280-0.75×A2605. 由于蛋白質的紫外吸收高峰常因pH變化而改變，故應用此法時要注意溶液的pH。最好樣品的pH與標準曲線制定時的pH一致。第五部分 凝集素的糖抑制試驗一、原理細胞膜是雙層脂鑲嵌蛋白質結構，脂和蛋白質又能與糖

5、分子結合為細胞表面的分枝狀糖外被。目前認為：細胞間的聯系，細胞的生長和分化，免疫反應和腫瘤發生都和細胞表面的分枝狀糖分子有關。凝集素（Lectin）是一類能夠專一性，可逆性地與糖結合的蛋白質或糖蛋白，它具有凝集細胞刺激細胞分裂的作用。由于它與細胞表面的糖分子連接，在細胞間形成橋的結果，加入與凝集素互補的糖可以抑制該凝集素對細胞的凝集。不同凝集素有其特異性結合的糖的類型，在此，我們通過糖抑制試驗確定植物凝集素的糖結合特異性。二、設備與試劑1.設備1）96孔培養板；2）移液槍；3）普通光學顯微鏡；4）蓋玻片；5）玻璃燒杯；6）EP管7）擦鏡紙2.試劑1）樣品溶液；2）兔血紅細胞懸液；3）糖或糖蛋白溶液；4）生理鹽水三、方法與步驟1.首先加入20ul初始濃度為1mg/ml倍比稀釋的樣品溶液。2.每孔加入20ul的糖（初