1、雙分子熒光互補技術及其在蛋白質相互作用研究中的應用摘 要雙分子熒光互補技術是近年發展起來的用于體內或體外檢測蛋白質相互作用的一項新技術。該技術是將熒光蛋白在合適的位點切開形成不發熒光的2個片段，這2個片段借助融合于其上的目標蛋白的相互作用，彼此靠近，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，從而產生熒光。BiFC方法簡單直觀，具有可視性的特點，對溫度敏感，熒光片段種類較多，被廣泛地應用到不同的細胞中，既可以檢測蛋白之間的相互作用，也可以定位蛋白質相互作用的位點。此外，BiFC還能在蛋白構型的確定以及RNA的檢測方面發揮作用。經過若干年的發展，雙色熒光互補技術已經發展成包括多色熒光互補技術，BiF

2、C和FRET聯用技術以及BiFC和YTH聯用技術在內的多種技術，拓寬了BiFC的應用。關鍵詞：雙分子熒光互補技術；蛋白質片段互補； 熒光蛋白； 蛋白質相互作用蛋白質之間的相互作用(Protein-protein interactions，PPIs)形成了細胞中的調節網絡，用來調控細胞的許多功能。因此，研究蛋白之間的相互作用對于深入了解許多生命過程具有非常重要的意義。迄今為止，已經建立了多種技術和方法用于研究蛋白與蛋白之間的相互作用，如酵母雙雜交技術(Yeast two-hybrid, YTH)，熒光共振能量遷移(Fluorescence resonance energy transfer, F

3、RET)和蛋白片段互補技術(Protein fragment complementations, PFCs)等方法(表1)。在蛋白片段互補技術中，雙分子熒光互補技術(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)由于觀察直觀，檢測方便以及能實現在活細胞中對相互作用蛋白可視化等諸多優點，自從其被開發出來后，便得到了廣泛地應用。1 雙分子熒光互補技術的提出及理論依據BiFC技術本質上是一種蛋白質片段互補技術，是指將熒光蛋白多肽鏈在某些不保守的氨基酸處切開，形成不發熒光的N-和C-末端2個多肽片段。將這2個熒光蛋白片段分別連接到1對能發生相互作用的目標

4、蛋白上，在細胞內共表達或體外混合這2個融合蛋白時，由于目標蛋白質的相互作用，熒光蛋白的2個片段在空間上互相靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，從而產生熒光1(圖1)。目前用于BiFC技術的熒光蛋白包括GFP(Green fluorescent protein，綠色熒光蛋白)2，YFP(Yellow fluorescent protein，黃色熒光蛋白)3，CFP(Cyan fluorescent protein，青色熒光蛋白)1，BFP(Blue fluorescent protein，藍色熒光蛋白)4和RFP(Red fluorescent protein，紅色熒光蛋白)5等。

5、最先將熒光蛋白用于蛋白互補實驗的是Ghosh等人2。2002年Hu等人在此基礎上首次提出了BiFC這個概念。他們將1個GFP的突變子增強型黃色熒光蛋白(EYFP)從不同位點切開，用1組相互作用的同向平行的亮氨酸拉鏈(多肽bFos和bJun)融合到切開的YFP蛋白的N片段和C片段，分別在大腸桿菌中共表達不同組合的融合多肽。他們發現，當EYFP從氨基酸Ala154-Asp155間切時所構建的1組融合多肽，能夠在細菌細胞中產生YFP的熒光。他們將這個技術稱之為BiFC，并對BiFC的相關性質以及影響因素進行了詳細的討論。這篇文章的發表標志著BiFC作為一種可視化觀察蛋白質相互作用的技術被正式建立起來

6、3。自此，不同的熒光蛋白突變體被運用到BiFC系統中用來提高熒光強度、增加熒光顏色或減少背景熒光等(表2)。從BiFC的原理可以看出，構成BiFC技術的三大理論依據分別是蛋白質剪接(Protein splicing)機制的發現，蛋白質片段互補技術(Protein fragment complementation)的提出以及綠色熒光蛋白結構與功能的解析。2 雙分子熒光互補技術(BiFC)的特點2.1 可視化可視化是BiFC技術最大的特點。在此技術中，熒光蛋白由于相互靠近而重新構成能發出熒光的蛋白，這種熒光是自我催化的結果，不需要底物與輔助因子，非常穩定，而且通過熒光顯微鏡和流式細胞儀等常規儀器很

7、容易檢測到BiFC信號，這種直觀性使得BiFC技術在短短幾年迅速獲得應用，已經成為檢測活體細胞中蛋白質相互作用的一種常規方法。這種可視性既可以直觀地觀察到蛋白的相互作用，而且還能通過對這種可視化的熒光進行定量從而確定蛋白相互作用的強弱，極大地方便了蛋白相互作用之間的研究。2002年Hu等3首次在動物活細胞中運用GFP及其突變體研究蛋白與蛋白間的相互作用。他們鑒定了7個BiFC復合體(BN173/CC155，CN155/CC155，CN173/CC155，GN173/CC155，YN154/YC155，YN173/YC155和YN173/YC173)，觀察顯示藍色、藍綠色、綠色和黃色熒光。Lee

8、7等將Venus和Cerulean熒光蛋白片段在活細胞中混合可在不同位置觀察到不同顏色的熒光出現。2.2 可以應用到不同的宿主細胞中熒光蛋白結構穩定，能在非厭氧條件下的幾乎所有細胞中表達，這種穩定性極大地拓寬了熒光蛋白的應用范圍。迄今為止，各種BiFC系統已經被成功用于不同宿主細胞中，包括動物12，植物5，真菌10,13和細菌3中；除了體內，BiFC技術還能應用于體外試驗中2-3。Hoff10利用BiFC技術分析來自絲狀真菌(Acremonium chrysogenum)活細胞中復制因子AcFKH1和CPCR1之間的蛋白與蛋白相互作用。Hu等人最初進行BiFC實驗選擇的便是大腸桿菌3。Yang

9、等12通過改變哺乳動物的表達密碼子可以有效改善GFP在真核生物中的表達亮度。目前報道在活細胞內運用BiFC研究G蛋白(異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白)信號傳導過程中核心部件蛋白間相互作用13。2.3 熒光蛋白片段種類多在眾多的蛋白片段互補技術中，雙分子熒光互補技術中可選擇的互補蛋白片段更多，主要體現在如下3方面。首先，熒光蛋白自身種類多，綠色熒光蛋白通過突變，可以形成激發波長不一樣的熒光蛋白，如YFP，BFP，CFP和RFP等；其次，同一種熒光蛋白可以在不同位置剪切成能進行功能互補的熒光片段；第三，不同的熒光片段之間可以進行功能互補。互補的熒光片段種類多，使得通過熒光互補技術在同一細胞中觀察多

10、個蛋白的相互作用成為可能1。BiFC系統中運用較多的為YFP。其突變體Citrine和Venus能改善YFP突變體的附加氨基酸交換，可增強熒光蛋白的明亮度和折疊程度。BiFC的特殊地方體現在如果蛋白高度集中表達甚至它們沒有特定的親和力，也可能觀察到非特異性相互作用15。2.4 BiFC系統對溫度敏感BiFC技術的最大缺陷是多個BiFC系統對溫度敏感。溫度高時，片段間不易互補形成完整的熒光蛋白。一般在30以下形成互補效應好，溫度越低，越有利于片段之間的互補，這就對研究細胞在生理條件下的蛋白質相互作用帶來不利因素。目前，只有基于Venus、Citrine和Cerulean的3個雙分子熒光互補系統可

11、以在生理溫度條件下實現片段互補8。此外，BiFC系統需要2個熒光蛋白片段互補，重新形成完整的活性蛋白以及發生熒光蛋白自體催化過程，不同的BiFC系統往往需要幾分鐘到幾小時完成該過程，因此觀察到的雙分子熒光信號滯后于蛋白質的相互作用過程，不能實時地觀察蛋白的相互作用或蛋白復合物的形成過程。Zhang等16利用遠紅熒光蛋白(mKate)的BiFC系統對腫瘤和神經疾病相關的蛋白質進行了研究。這種遠紅外蛋白可在37的生理溫度下發生相互作用。2.5 BiFC復合物的形成過程可逆最初的研究表明，熒光蛋白分子通過蛋白互補，形成的BiFC復合物不可逆1,3-4，然而，Sung等人的實驗卻表明，BiFC復合物的

12、形成是可逆的。在研究Pho2和Pho4相互作用時，Sung等分別將Pho2和Pho4與黃色熒光蛋白突變體Venus的兩個熒光片段成2個融合蛋白，當含有這2個融合蛋白的釀酒酵母二倍體細胞從不含磷酸鹽的培養集中轉移到含高濃度磷酸鹽的培養基中時，BiFC熒光消失，然而當該細胞重新恢復磷酸鹽饑餓時，BiFC信號重新出現13。這種特點使得通過BiFC技術來研究蛋白相互作用的動態變化成為可能。2.6 通過定點突變可有效減少假陽性結果的出現在實驗中，一些陰性對照的信號在檢測蛋白與蛋白相互作用中較高，這將造成假陽性結果。可能的原因是最初分開的2個無熒光的片段具有內在的親和力，導致無特定相互作用的自發組裝。由于

13、這個局限，BiFC的高靈敏度、時空分辨率和準確性受到質疑。研究表明通過定點缺失和定點突變改變蛋白相互作用可有效減少假陽性結果的出現。目前報道的利用分割超折疊的GFP(sfGFP)來構建BiFC6。將sfGFP從214和215氨基酸之間分開(sfGFPN:1-214氨基酸;sfGFPC:215-229氨基酸)，將sfGFPN和sfGFPC分別與目標蛋白融合。由于sfGFPC的N端存在兩個調控氨基酸殘基R215和D216，將其通過缺失突變后，發現可有效減少陰性信號的調節。Lin等17利用在Venus中對BiFC片段進行1個點突變(V150L)能有效減少BiFC的背景熒光。3 雙分子熒光互補技術的應

14、用3.1 亞細胞定位BiFC尤為適合蛋白復合物的亞細胞定位。利用BiFC能夠獲取活細胞中蛋白質相互作用復合物的亞細胞定位信息，從而為我們推斷蛋白質的生物學功能提供必要的基礎信息。Hu等人在活細胞中用BIFC分析了包含bzip結構域的Jun和Fos的互作及其定位情況，以及bzip和Rel家族的互作和信號系統對它們的作用和定位調節。結果發現bzip外區決定了蛋白作用位置，跨家族的相互作用影響了它們的定位和轉錄活性調節18。CD99是一種表面糖蛋白、白細胞抗原，并且不屬于已知的任何蛋白家族Gowoon Choi等人利用BiFC證明了CD99能形成同源二聚體，并且還將互作定位在細胞核的周圍區域。3.2

15、 轉錄因子間的互作研究BiFC已經用于許多結構類別的轉錄因子之間的互作研究.這些研究使我們對核內蛋白互作及其亞核定位的理解更為精細，還可能為我們理解核功能的區室化提供重要線索.轉錄因子Mstl屬于基本螺旋一環一螺旋家族(bHLH)的成員，在胰腺腺泡細胞中表達，對胰腺外分泌功能有重要的作用.Zhu L.Q等發現MstlYN、Mstl一YC能形成熒光，而bHLH的螺旋的突變體Msti1MH-YC和MstlYN之間沒有熒光。結果表明抑制轉錄因子Mstl同源二聚體的形成將導致胰腺腺泡向腺管的化生19。脯氨酸脫氫酶(ProDH)是催化脯氨酸降解的第一步，是堿性亮氨酸拉鏈S族(bZipS)轉錄因子AtbZ

16、IP53的靶基因.Fridtjof Weltmeier等人應用BiFC證明AtbZIP53不與本族的成員互作，而是與bZip C族的AtbZIP10強烈互作，從而調節ProDH的轉錄。這種異源二聚化介導的轉錄激活是調節轉錄因子活動與功能的重要機制。3.3 酶-底物復合物的確定BiFC已經用于幾種酶-底物互作的確定，其中包括泛素連接酶、激酶、鳥嘌呤核苷酸交換因子。在活體內確定酶的特殊性底物及其活性位點可為酶新功能的發現提供重要證據。例如，Cengiz Ozalp等應用BiFC系統研究了細胞色素P450單加氧酶系統，在活細胞天然膜狀態下驗證了細胞色素P450與細胞色素P450還原酶的互作，并且提出

17、了P450還原酶與P450反應中可能存在新的作用方式20。Blonde等利用BiFC研究了釀酒酵母中泛素E3連接酶Grr1和細胞分裂M期調節因子Hof1的互作，而 Hof1由Grr1的酶促降解是酵母胞質分裂過程中激動蛋白收縮的重要步驟。3.4 信號轉導級聯通過BiFC分析，實現了信號轉導網絡中許多信號蛋白互作的可視化.膜連蛋白A4是一種鈣結合蛋白，Alen Piljic等通過BiFC驗證了與它連接的磷酸激酶催化亞基與調節亞基的互作，體內鈣離子水平的升高會刺激膜連蛋白A4攜帶磷酸激酶的催化亞基與調節亞基從胞質、核質向胞膜、核膜轉移20。SMAD家族轉錄因子介導轉化生長因子的信號發生，通過BiFC

18、分析，Remy等闡明SMAD3-SMAD4復合物定位于胞核而SMAD與AKT/PKB(蛋白激酶B)則阻止它向核的轉移。3.5 蛋白復合物定位調節BiFC還適用于蛋白互作復合物的動態研究。例如HuC.D等用BiFC證明轉錄因子JUN和ATF2形成的異源二聚體分布在細胞質，一旦受到由脅迫激活的蛋白激酶的刺激后，將轉移到胞核18。Niu T.K用BiFC分析發現鳥嘌呤核苷酸交換因子GBF1和鳥苷酸鳥苷三磷酸酶（GTPase）ARF1（ADP核糖基化因子）形成的復合物受到布雷菲德菌素脅迫將會在細胞高爾基體富集19。3.6 涉及轉錄后修飾的互作許多蛋白互作需要特殊的轉錄后修飾，這類互作也可以通過BiFC

19、在活體內分析Kanno等發現溴域蛋白BRD2有選擇性的和乙酰化的組蛋白結合，這種結合不僅要求BRD2的溴域還要求組蛋白有乙酰化的尾部。Nyfeler發現耐藥相關基因ERGIC53受體與組織蛋白酶Z和組織蛋白酶C的互作要求ERGIC53的凝集素結合結構域，這表明它們之間的互作要求配基糖基化。因此BiFC能夠監視轉錄后發生的改變蛋白互作的修飾作用。3.7 監視新的互作蛋白互補分析以及特殊的酵母雙雜交轉錄激活分析已經用來確定很多蛋白的新互作蛋白Remy等使用BiFC文庫監視方法確定了AKT/PKB的新的互作蛋白Ft1蛋白。以BiFC為基礎的文庫監視方式其優勢是能在活體內監視蛋白互作，并且能直接觀察到

20、刺激對互作的影響。缺點是在實驗條件下蛋白表達水平的差異可能影響目的蛋白互作蛋白的確定。但是在特殊的細胞條件下，BiFC仍然能確定目的蛋白的互作蛋白。3.8 大分子復合物和分子骨架把熒光蛋白帶到一起恢復熒光活性并一定由互作蛋白直接接觸發生，融合蛋白通過被大分子復合物組裝帶到一起也能在互作蛋白不接觸的情況下產生互補熒光。類似地，融合蛋白和同一個大分子骨架結合，即使互作蛋白不直接接觸也能產生熒光。比如Rackham等利用BiFC分析了與mRNA結合的人類zipcode結合蛋白(IMP1)和智力發育延遲蛋白(FMPR)互作的可視化21。Stains等通過BiFC在活體內實現了定位在寡聚核苷酸上的鋅指D

21、NA結合蛋白同源互作的可視化。3.9 multicolour BiFC研究發現由不同熒光蛋白的片段組成的雙分子熒光復合物和由同一種熒光蛋白片段組成復合物有不同的光譜。這些復合物之間的不同光譜實現了同一細胞中多種蛋白復合物之間的可視化，這就是multicolour BiFC的原理。因此雙分子熒光還能進行有共同互作蛋白的競爭性蛋白互作的研究。例如Hu等已用multicolour BiFC來確定bZIP結構域中Fos、Jun和ATF2轉錄因子形成二聚體的效率，并證明了Fos與Jun異源二聚體的形成效率遠高于Fos與ATF2以及Jun與ATF2異源二聚體的形成效率。Grinberg等用多色BiFC比較

22、了Max與bMyc結構域的互作效率和Max與Mad家族轉錄因子互作效率的差異。多種復合物分布的直接比較不僅消除了尋找跟復合物亞細胞定位相同的標記物，還能幫助確定復合物的不同定位是定位信號所致還是復合物在細胞內的不同功能所致。3.10 檢測泛素化途徑泛素(ubiquitin，Ub)是含76個氨基酸殘基的多肽，分子質量約8.5ku，高度保守，廣泛存在于各種真核細胞中。它的主要作用是以多聚泛素鏈的形式與要降解的底物蛋白結合，從而標記底物蛋白。Muller等還發現一種類泛素蛋白 SUMO，它也標記底物，但不促進其降解。一個或多個泛素分子在一系列酶的作用下與其他蛋白質分子共價結合就稱為泛素化。泛素化可直

23、接影響蛋白質的活性及其細胞內定位。細胞內許多蛋白質均可被泛素化系統識別和修飾，包括細胞表面受體、信號傳導蛋白、轉錄因子等。泛素化過程是一個由多種酶參與的級聯反。首先，在ATP的參與下，泛素激活酶(E1)作用于泛素羧基端的谷氨酸殘基，并將其激活。接著，活化了的泛素蛋白利用高能巰基鍵與泛素結合酶(E2)的半胱氨酸殘基結合。最后，E2直接或者通過泛素連接酶(E3)將泛素與靶蛋白連接，從而完成泛素化的過程。泛素化的靶蛋白可被細胞中的26 S蛋白酶體識別，從而將其降解。目前越來越多的研究發現，泛素化系統的改變和細胞的轉化與腫瘤的發生、神經退行性疾病、免疫和炎癥反應等有密切關系。BiFC技術為泛素化途徑檢

24、測提供了一種簡便方法。Fang等21用YN標記泛素分子，YC標記泛素作用底物Jun，pFLAG-CMV2()-YN-Ub和pFLAG-CMV2()-YC-Jun共染細胞 COS-1，37培養24h，再30培養416h后進行熒光檢測。若出現熒光，則表明泛素結合到了底物蛋白上，即底物蛋白被泛素化。經對表達YN-Ub(帶Flag標記)的細胞提取物和表達HA-Ub的細胞提取物作蛋白質印跡分析，發現電泳后的蛋白質條帶亮度和彌散情況基本相同，僅有由于YN分子質量較HA大而引起的條帶稍微滯后，該結果說明，在泛素分子上融合表達一段熒光蛋白不會影響泛素與其底物的結合。3.11 用于檢測RNABiFC 對細胞內的

25、RNA可進行特異性標記。Valencia Burton 等22用基于GFP的BiFC系統成功在大腸桿菌中標記了mRNA和5S核糖體RNA。他們將真核生物的翻譯起始因子(eIF4A)切成2個結構域，分別與GFP的2個片段融合形成融合蛋白。RNA的末端連有eIF4A蛋白的RNA適配子。將其導入細菌后，融合蛋白之間發生相互作用，蛋白表達可特異性的反應到RNA適配器上。GFP重新組成發出熒光，可以照亮連接在eIF4A蛋白的RNA。Ozawa等23同樣用基于GFP的BiFC系統研究了真核細胞線粒體RNA。借助雙分子熒光互補技術來標記RNA為研究RNA提供了新的工具，也拓寬了BiFC技術的應用范圍。4 影

26、響BiFC實驗的因素分析在BiFC實驗中影響因素有很多，除了宿主細胞和熒光蛋白的種類外，還有形成融合蛋白時插入到熒光蛋白片段上的小肽和熒光蛋白的位置。4.1 Linker的序列通常在熒光蛋白質片段與目標蛋白質之間加1個連接肽，防止由于蛋白質空間位阻導致蛋白片段間不能相互靠近現象出現。常用的連接肽氨基酸序列有RSIAT、RPACK-IPNDLKQKVMNH1,3和GGGGS11等。linker為單鏈結構，因此存在空間位置上的旋轉靈活性，這使熒光蛋白片段更容易相互靠近發生相互作用，重新產生熒光。4. 2 熒光蛋白片段的位置在BiFC試驗中，熒光蛋白片段的位置對結果的影響是顯著的。Sung等人在研究

27、Cet1的寡聚化作用時，發現將Venus的VN或VC分別連接在Cet1的C末端時，在細胞核中檢測不到熒光；將VN或VC分別連接在Cet1的N末端時，在細胞核中檢測到了強烈的熒光，而將VN連接到Cet1的N末端，而將VC連接到Cet1的C末端，這樣形成的BiFC復合物信號較弱，產生的熒光強度也較弱，造成這種差異的原因可能和表達的蛋白之間的拓撲約束有關。熒光片段位置的差異會導致BiFC實驗的差異13。這個現象被Chandlter等人在植物中得到了證明。為了證明BIM1和DRN蛋白之間的相互作用，Chandlter等人構建了4個載體，即分別將BIM1和DRN融合到YFP的N末端和C末端，如此構建的載

28、體分別是：BIM1-YFP，DRN-YFP，YFP-BIM1和YFP-DRN。結果發現，只有將BIM1-YFP和YFP-DRN配對，才能產生BiFC復合物。這個實驗再次表明，熒光蛋白片段位置的不同，對雙分子熒光互補實驗的成敗起著十分重要的作用24。5 BiFC系統的擴展5.1 多色熒光互補技術2003年，Hu等人在BiFC的基礎上建立起了多色熒光蛋白互補技術(Multicolor fluorescence complementation analysis)。和BiFC一次只能檢測一組相互作用蛋白不同的是，這種技術能同時檢測一個細胞中多組蛋白的相互作用。他們將GFP、CFP、YFP和BFP分別在

29、特定位置切開后與目標蛋白連在一起形成融合蛋白，然后將這些融合蛋白混合。不同的目標蛋白間會發生相互作用，同時使不同的互補熒光蛋白片段結合，形成多個蛋白復合體。通過熒光顯微鏡可觀察到不同顏色的熒光1。這為研究蛋白功能奠定了一定的基礎。多個BiFC系統運用到植物中。Lee 等7在植物細胞中將目標蛋白分別標記上CFP的C-端片段(cCFP)，Venus和Cerulean的N-端片段(nVenus或nCerulean)，cCFP 融合蛋白和nVenus融合蛋白發生相互作用呈現黃色熒光；而cCFP融合蛋白和nCerulean融合蛋白相互作用則呈現藍色熒光。根據發光顏色的不用來觀察不同蛋白間的相互作用。Zh

30、ang等25在線蟲中利用多色熒光研究重疊基因表達模型。目前報道的在洋蔥表皮細胞中運用多色BiFC研究不同蛋白間的相互作用。其片段來自GFP及它的突變體CFP、YFP和紅色熒光蛋白突變體(DsRed-Monomer)26。通過鑒定來自CFP、GFP、YFP 片段的9個不同BiFC復合體和一個來自DsRed-Monomer片段的BiFC 復合體，結果發現GFP 片段和DsRed-Monomer片段間的組合沒有熒光出現。這說明不是任何的熒光蛋白片段C-端和N-端之間能發生相互作用。這為篩選到相互作用的熒光蛋白提供了一種可行的方法。Waadt等27用同樣的方法在植物細胞中呈現兩個蛋白復合體(CN173

31、/CC156和CN173/YC156)。通過觀察西紅柿中未成熟蛋白(NR)與乙烯感受器(LeCTR)間的相互作用來探究乙烯信號的傳導28，有無熒光可作為NR-LeCTR相互作用的指示。5.2 BiFC和FRET聯用技術FRET技術要求在距離10nm范圍內，供體發射波譜和受體激發波譜有一定程度的重疊，并且，FRET技術需要精密的儀器并進行復雜的數據分析。這種方法檢測的是供體和受體的熒光強度的變化。通過2個有區別的光譜BiFC可建立熒光共振能量轉移(FRET)。近來，Shyu29在動物細胞中將BiFC和FRET聯合實現3個蛋白復合體同時呈現在同一細胞中，通過CFP/YFP與YN173/YC155和

32、Cerulean(CFP 突變體)一起FRET來實現，所以將來有可能實現在同一細胞內同時呈現 4 個蛋白復合體。5.3 BiFC和YTH聯用技術Zheng 等30利用基于GFP和YFP的BiFC系統和YTH技術聯用來研究蘿卜花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)中輔助蛋白酶組件(Helper component-proteinase, HC-Pro)在釀酒酵母、植物和昆蟲細胞中自我相互作用。這一研究為在特定時間和空間上控制病毒侵染提供了理論依據。BiFC可以彌補YTH技術不足的方面，例如，有些外源蛋白在酵母體內處于不同的位置，幾乎沒有可能發生相互作用，而BiFC技術可直

33、接觀測到細胞中蛋白質間相互作用的位置。6 挑戰與前景蛋白互作與修飾的研究能對我們理解生物調節機制提供重大幫助。而在活細胞或有機體內實現蛋白互作與修飾可視化是理解研究這些機制的重要條件。BiFC及以其為基礎發展出來的分析方法是實現活體內蛋白互作與泛素家族結合反應可視化的重要工具。研究表明這些分析方法能廣泛應用于許多結構、功能不同的蛋白互作與修飾的研究。這些分析已經用于不同的細胞株與有機體，并未發現沒有它們在任何實驗材料系統出現不適用。現行的熒光互補技術是一種有力的實驗工具，但是有些特點也限制了它的應用。比如熒光片段在沒有連接互作蛋白時可能發生自發互補，這是雙分子熒光互補中的主要背景信號。我們可以

34、通過連接不發生互作的蛋白來消除這種背景信號，或者給載體連接較弱的啟動子減弱蛋白表達水平。我們下一步發展的方向是能減弱自發互補但不影響它們連有互作蛋白時互補的熒光系統，從而使系統受蛋白表達水平影響降低。還有熒光片段互補連接后的不可逆性，由于體內蛋白的互作是一個動態過程，蛋白A與蛋白B互作結束后，還可能發生蛋白A與蛋白C的互作，熒光片段互補連接后的不可逆性限制了這種蛋白互作的動態學過程研究。另外，盡管BiFC不要求知道互作蛋白的結構信息，對互作蛋白間的距離和位置取向也沒有特殊要求，但是空間位阻能阻止熒光片段互補的形成。因此，可在熒光片段和融合蛋白之間一段短肽連接物以消除空間位阻。最后，BiFC系統

35、的兩個熒光蛋白互補片段重新形成完整的活性蛋白時，不同的BiFC系統需要不同的時間，從幾十分鐘到幾小時不等。如果雙分子熒光信號滯后于蛋白質相互作用過程，就不能實時觀察蛋白的相互作用或蛋白復合物的形成過程。雖然我們發展了許多具有重要特性的熒光蛋白突變體，但是在熒光形成的化學反應速率上并沒有很大提高。盡管如此，我們堅信隨著BiFC基礎理論研究的深入和新的性能優異的互補片段的發掘，BiFC將會越來越完善，它必將在蛋白質相互作用以及翻譯后修飾的研究中具有更加廣泛的應用前景，也必將會為蛋白組學和生命科學帶來福音。參考文獻1Hu CD, erppola TK. Simultaneous visualizat

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