細菌內毒素檢查法

?中國藥典?2021年版培訓班山東省藥品檢驗所主要內容細菌內毒素檢查相關理論及概念?中國藥典?2021年版增修訂情況細菌內毒素檢查法及本卷須知細菌內毒素檢查相關理論及概念細菌內毒素鱟試劑鱟試劑與內毒素的反響機理細菌內毒素檢查名詞解釋細菌內毒素檢查法〔BacterialEndotoxinstest〕熱原檢查法〔Pyrogentest〕LAL(Limulusamebocytelysate)TestTAL(Tachypleusamebocytelysate)TestLimulusTest細菌內毒素的發現細菌內毒素這個概念在1890年的時候就已被提了出來，它是在研究發熱物質過程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠傷寒桿菌提取出來，進行化學免疫學方面的研究，到1940年時候，Morgan使用志賀氏痢疾菌說明了細菌內毒素是由多糖脂質及蛋白質三局部所組成的復合體，到了1950年以后，隨著生物學，物理化學，免疫學以及遺傳學等的進步開展，細菌內毒素的研究工作，尤其是其化學結構組成及各種生物活性間的關系也更加明確起來。Boivin：Morgan：內毒素是由多糖、脂質和蛋白質組成的復合體。脂多糖又由化學和生物性質不同的特異O抗原、核心多糖和類脂A〔脂質A〕組成。

內毒素的多糖結構細菌內毒素參考品的建立不同細菌的內毒素對于鱟試劑的反響活性不同，為保證鱟實驗法的平行性和重復性，要建立一種內毒素的標準物質作為實驗中的控制標準。由于大腸桿菌內毒素在天然內毒素中的致熱活性比較高，在各種細菌內毒素對鱟試劑反響的靈敏性上處于中值的位置，且其穩定、可溶，因此一般都采用大腸桿菌的內毒素作為標準內毒素參考品。

標準內毒素與環境內毒素標準內毒素：指經人工提取精制并經生物效價測定的細菌內毒素，作為細菌內毒素檢查的參考品。國際標準品〔IS〕參考標準品〔RSE〕國家標準品〔NS/RSE〕標準內毒素

工作標準品〔CSE〕

80年代以前以重量作為內毒素的單位1982年USP20引入以生物效價為量值的內毒素單位〔EU，EndotoxinUnit〕細菌內毒素的量值CP2021年版規定內毒素標準品溶解后要在旋渦混合器上混合15分鐘，以后的每一步稀釋前要至少混合30秒，其他國家藥典也有類似要求；具有兩極活性的內毒素分子在水中呈現不均勻分布不按要求進行旋渦混合會使所稀釋的內毒素效價偏低，造成靈敏度標示偏高、陽性對照不凝等不正確的實驗結果

細菌內毒素標準品的稀釋鱟是一種海洋無脊椎動物，藍色的血液。種類以及分布：美洲鱟：北美洲東岸海域中國鱟：中國東南沿海南方鱟：泰國和馬來群島海域圓尾鱟：東南亞西部海域

世界上現存鱟的種類鱟試驗的發現

1956年JohnsHophins大學動物學家Frederik.Bang發現革蘭陰性細菌的粗制品能使鱟的血細胞凝聚。1963～1964年和Bang對細菌引起鱟血凝聚進行研究，用內毒素和鱟血細胞溶解物證明鱟血凝聚機制是一種酶反響。多位學者對鱟血細胞溶解物〔LAL〕進行研究，闡釋了凝聚機制鱟試劑：鱟血液變形細胞裂解物冷凍枯燥制備而成鱟試劑的種類：依據鱟的種類分：美洲鱟試劑〔LAL〕中國鱟試劑〔TAL〕圓尾鱟試劑〔CAL〕依據檢查方法分：凝膠法鱟試劑和定量法鱟試劑依據內毒素和鱟試劑反響的專一程度分：普通鱟試劑和特異性鱟試劑鱟試劑與分類C因子活化的C因子內毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反應）G因子二價陽離子凝膠法鱟試劑與內毒素的反響機理——復雜的酶促反響過程BET的目的和前提確保藥品不含有能導致患者發熱反響發生的足量的細菌內毒素。一定量的細菌內毒素可以被人體耐受，也是SFDA允許的。前提是假定引起發熱反響的熱原幾乎全部是內毒素。二、2021年版?中國藥典?細菌內毒素檢查法增修訂情況2021版與2005版區別修訂背景注射用藥品、生物制品建立細菌內毒素檢查法指導原那么2021版與2005版區別2010版2005年版1、細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水凝膠法細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。光度測定法用的細菌內毒素檢查用水，其內毒素的含量應小于0.005EU/ml2、本試驗操作過程應防止微生物和內毒素的污染試驗操作過程應防止微生物的污染2010版2005年版3、1EU與1個內毒素國際單位（IU）相當----4、常用干熱滅菌法（250℃、30分鐘以上）去除常用的方法是在250℃干烤至少60分鐘5、刪除對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產廠家推薦的適宜的緩沖液調節pH值。2010版2005年版6、內毒素限值按L=K/M計算，M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62m2計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉換為每千克體重劑量（M）內毒素限值按L=K/M計算，M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均體重按60kg計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。7、細節語言文字方面凝膠限度試驗Antilg加入內毒素的溶液處方至少2有任何可能會影響凝膠限量試驗Lg-1配制內毒素的溶液配方不少于2個發生了任何可能會影響修訂背景1、細菌內毒素與檢查用水除了強調內毒素含量外，還強調應對內毒素試驗無干擾作用。2、強調用干熱滅菌法〔250℃、30分鐘以上〕去除內毒素與熱原法同步。3、根據某些藥〔如抗腫瘤藥〕用體外表積計算給藥量的需要，增加了按體外表積給藥時的計算方法。注射用藥品、生物制品建立細菌內毒素檢查法指導原那么

本原那么依據2021年版藥典制訂，適用于注射用藥品、生物制品建立細菌內毒素檢查工程時進行的實驗及研究。需建立內毒素檢查工程的品種質量標準中有家兔熱原檢查法需轉換為細菌內毒素檢查方法的品種。用于注射給藥，但未有熱原質量控制的品種。注射用新藥需建立熱原質量控制的品種。用于靜脈給藥的原輔料建立方法時對鱟試劑及樣品的要求同時使用兩個鱟試劑廠家的鱟試劑每個品種至少三批樣品〔上市品種應檢測兩個以上生產廠家；新藥需檢測連續生產的樣品〕。確定內毒素限值一般按公式L=K/M計算。M為人每公斤每小時臨床最大用藥劑量，依據藥品使用說明書，?臨床用藥須知?確定。兒童用藥如大于成人，以兒童為準。為保障平安用藥，對于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品、需聯合用藥的藥品，可根據計算值適當調整，嚴格至計算限值的1/2或1/3。對于體積在100ml以上〔包括100ml〕的復方靜脈輸液類品種，內毒素限值一般按計。其他單方靜脈輸液品種除另有規定外也可按用藥劑量計算，以EU/mg或EU/U表示。對于美國、歐洲或日本藥典已收載的，并已建立細菌內毒素檢查法的品種可參考國外藥典規定的限值，與按公式計算出的數值比較，以嚴格者為該品種的限值。如果使用的是國外藥典的限值，應以最新版本藥典為準。干擾實驗建議使用較低靈敏度鱟試劑或0.25EU/ml),以防止供試品中內毒素的陽性影響。三、細菌內毒素檢查法細菌內毒素檢查法定義：本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。細菌內毒素的量用內毒素單位(EU)表示。1、概述

凝膠法光度測定法濁度法〔終點濁度法和動態濁度法〕顯色基質法〔終點顯色法和動態顯色法〕凝膠法最簡單、經濟、應用最廣泛，中國藥典的“仲裁〞方法對干擾相對不敏感。有兩倍的誤差較光度測定法不靈敏光度測定法靈敏〔動態濁度檢測限，動態顯色〕檢測范圍寬〔動態濁度到達100EU/ml,動態顯色50EU/ml〕較之凝膠法易受干擾對結果的解釋更慎重。實驗根本流程圖供試品限值確定最大有效稀釋倍數確定供試品干擾實驗

正式實驗結果判斷2.試劑、儀器設備等細菌內毒素檢查法所應用的試劑，主要包括：鱟試劑、細菌內毒素檢查用水、細菌內毒素工作標準品等。國內鱟試劑的生產情況安度斯生物技術湛江海洋生物制品廠福州新北鱟試劑廠廈門鱟試劑廠福州東方鱟試劑廠福州平潭東方鱟試劑廠廣西北海鱟試劑廠細菌內毒素檢查用水

1.藥典規定：凝膠法：光度法：且對內毒素試驗無干擾作用2.和鱟試劑配套使用?細菌內毒素國家標準品(RSE)細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。

細菌內毒素工作標準品(CSE)

細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。儀器設備與實驗器具分析天平超凈工作臺細菌內毒素檢查專用干式恒溫器電熱恒溫枯燥箱旋渦混合器

實驗器具

試管架、鑷子、消毒棉球、稱量瓶(30mm×60mm)、刻度吸管(1、2、5、10、15ml)、各種試管、中號金屬飯盒、加樣器等。目前已有多種無熱原的一次性用品

實驗器具的洗滌與除內毒素

實驗中所使用的玻璃儀器清潔與否，直接影響試驗結果。實驗中使用的所有玻璃器具一般經洗液浸泡后，取出用自來水、純化水依次沖洗干凈〔可用純化水浸泡〕。實驗器具的洗滌與滅菌試驗中所用的器皿，需要經過處理，除去可能存在的外源性內毒素。常用的方法是250℃干烤至少30分鐘，到達規定時間后，關斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫，一般約需6～8小時。將沖洗干凈的試管、稱量瓶、玻璃小瓶置金屬飯盒內，吸管置金屬筒內，放入烤箱，于250℃干烤至少30分鐘，放冷，密閉保存備用。滅菌后的實驗器具應在規定時間內使用。實驗器具的洗滌與滅菌也可用其他適宜的方法，并應確證不干擾細菌內毒素的檢查。除去外源性內毒素的玻璃器皿應在規定內使用，否那么須再次除去可能存在的外源性內毒素。試驗操作過程應防止微生物和內毒素的污染。3.供試品溶液的配制

按各藥品項下規定，取供試品，精密稱定于稱量瓶(事先已除去外源性內毒素)中，按其效價或含量，用各藥品項下規定的稀釋劑稀釋至規定濃度，充分搖勻使完全溶解，放置5～10分鐘，再搖勻,放置備用。

3.供試品溶液的配制

一般要求供試品溶液的pH值在～的范圍內。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液的pH值，可以使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調節pH值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢查用水在已經去除內毒素的容器中配制，緩沖液必須經過驗證不含內毒素或干擾因子。

3.供試品溶液的配制

本卷須知：1、供試品溶液的濃度如以**mg/ml表示，此**mg/ml是指供試品溶液中活性物質的濃度。2、樣品初試時一般按照樣品的估計百分含量或效價單位計算稀釋液溶劑參加量，復試時，那么必須根據該供試品的實際百分含量或效價來計算。3.考慮供試品本身的體積4.內毒素限值確實定內毒素限值L=K/M每小時靜注入人體內，不引起熱原反響的最大內毒素劑量〔閾值〕K=5EU/〔kg·h〕L為供試品的細菌內毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U〔活性單位〕表示；K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量,以EU/〔kg·h〕表示，注射劑K=5EU/〔kg·h〕，放射性藥品注射劑〔kg·h〕，鞘內用注射劑〔kg·h〕。M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/〔kg·h〕、mg/〔kg·h〕或U/〔kg·h〕表示，人均體重按60kg計算，人體外表積按2計算。注射時間假設缺乏1小時，按1小時計算。按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。內毒素限值大輸液注射用水

K=0.25EU/ml注意M一定要找到最大量，如果有兒童用量，按體重計一般高于成人量內毒素限值大局部藥品的內毒素限值=k/最大給藥劑量〔mg/kg〕假設劑量為，內毒素限值假設此產品的濃度為100mg/ml內毒素限值100=35EU/ml5.凝膠法鱟試劑靈敏度復核試驗當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

5、鱟試劑靈敏度復核試驗鱟試劑的標示靈敏度：在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，其單位用EU/ml表示。

5、鱟試劑靈敏度復核試驗1、取細菌內毒素國家標準品或工作標準品一支，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內。

5、鱟試劑靈敏度復核試驗2、將細菌內毒素國家標準品或工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解

，在旋渦混合器上混勻15分鐘

，然后根據鱟試劑標示靈敏度(λ)，制成2λ、λ、λ和λ4個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。

5、鱟試劑靈敏度復核試驗3、取鱟試劑，用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75％酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內。將鱟試劑按標示裝量復溶，輕輕轉動瓶壁，使內容物充分溶解，防止產生氣泡。取支的鱟試劑18支備用〔規格大于／支的鱟試劑按其標示量參加細菌內毒素檢查用水復溶后分裝〕。5、鱟試劑靈敏度復核試驗4、按檢查法項下試驗，將待復核的鱟試劑18管放在試管架上，排成5列，4列4管，1列2管，其中前4列分別參加4個不同濃度的內毒素標準溶液〔每1個內毒素濃度平行做4管〕，另一列2管參加細菌內毒素檢查用水。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕混勻，防止產生氣泡，垂直放入細菌內毒素檢查專用干式恒溫儀中，在37℃±1℃保溫60分鐘±2分鐘后，觀察并記錄結果。5、鱟試劑靈敏度復核試驗5、試驗結果中，如最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度管均為陰性，陰性對照均為陰性，按下式計算反響終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。λc＝antilg(ΣX/4)式中X為反響終點濃度的對數值(lg)。反響終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。5、鱟試劑靈敏度復核試驗6、當λc在λ～2λ(包括λ和2λ)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

結果判斷上圖：陽性以下圖：陰性6、供試品的干擾試驗當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須進行干擾試驗。

干擾試驗實際上是兩個鱟試劑靈敏度復核試驗：一個真正的鱟試劑靈敏度復核一個“鱟試劑靈敏度復核〞試驗是用一定濃度的供試品溶液替代BET水〔鱟試劑復溶仍采用BET水〕。也就是說“用供試品溶液將同一支細菌內素素標準品制成2λ、λ、λ和λ4個濃度的內毒素標準溶液〞進行干擾試驗一般步驟：供試品限值確定根據鱟試劑的靈敏度范圍確定MVD范圍〔供試品溶液濃度范圍〕預試驗〔初篩試驗〕確定樣品最大不干擾濃度正式干擾試驗預試驗通過一系列含有標準內毒素濃度為2λ的供試品溶液與后試劑反響，初步篩選出不干擾的濃度范圍。前提：供試品對內毒素檢查的干擾多數為抑制目的：防止干擾試驗的盲目性6、供試品的干擾試驗

1、按鱟試劑靈敏度復核試驗項下，用細菌內毒素檢查用水和未檢出內毒素的供試品溶液且不超過最大有效稀釋倍數(MVD)的溶液，分別制成含細菌內毒素工作標準品2λ、λ、λ和λ4個濃度的內毒素標準溶液系列C和B。

凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內毒素濃度/配制內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數所含內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液——————2B2λ/供試品溶液供試品溶液12*4*8*2λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D無/檢查用水——————2*注：稀釋倍數是指內毒素濃度，而其中供試品濃度是不變的6、供試品的干擾試驗

2、鱟試劑的準備：36支3、按檢查法項下試驗，照表一制備溶液A、B、C和D。將準備好的18管鱟試劑放在試管架上，排成5列，1列2管作為A，4列4管作為B，其中4列分別參加4個不同濃度的含供試品的內毒素標準溶液，另一列參加供試品溶液。6、供試品的干擾試驗將準備好的另外18管鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4管作為C，1列2管作為D，其中4列分別參加4個不同濃度的內毒素標準溶液，另一列參加細菌內毒素檢查用水。加樣結束后，用封口膜封口，輕輕混勻，防止產生氣泡，垂直放入細菌內毒素檢查專用干式恒溫儀中，在37℃±1℃保溫60分鐘±2分鐘后，觀察并記錄結果。

6、供試品的干擾試驗

4、試驗結果中，只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度符合范圍內時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C和B的反響終點濃度的幾何平均值(Es和Et)。6、供試品的干擾試驗Es＝antilg(ΣXs/4)Et＝antilg(ΣXt/4)

式中Xs、Xt分別為系列溶液C和B的反響終點濃度的對數值(lg)。6、供試品的干擾試驗當Es在λ～2λ(包括λ和2λ)及Et在～2Es(包括和2Es)時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。假設供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。6、供試品的干擾試驗供試品的最大有效稀釋倍數(MVD)按下式計算：MVD＝CL/λ式中：L：為供試品的細菌內毒素限值。C：為供試品溶液的濃度〔抗生素樣品濃度以活性成分計〕。當L以EU/ml表示時，C為，當L以EU/mg、EU/u表示時，C為mg/ml、u/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，那么MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。λ：鱟試劑的標示靈敏度〔EU/ml〕。7、凝膠限度試驗

編號內毒素濃度/被加入內毒素溶液平行管數A無/供試品溶液2B2λ/供試品溶液2C2λ/檢查用水2D無/檢查用水2A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照7、凝膠限度試驗1.供試品溶液的配制用細菌內毒素檢查用水將供試品配成對應MVD的濃度。2陽性對照液的制備：用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素工作標準品制成2λ濃度的內毒素溶液。7、凝膠限度試驗3供試品陽性對照液的制備：用被測供試品溶液將細菌內毒素工作標準品制成2λ濃度的內毒素溶液。實際工作中一般采用2倍MVD的供試品溶液和4λ的內毒素溶液等體積混合的方法配制，因此供試品稀釋過程要有2MVD和MVD兩個濃度，內毒素標準品稀釋要有4λ和2λ兩個濃度7、凝膠限度試驗4將8管鱟試劑放置在試管架上，其中2支參加按最大有效稀釋倍數稀釋的供試品溶液作為供試品管，2支參加陽性對照液作為陽性對照管，2支參加細菌內毒素檢查用水作為陰性對照，2支參加供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管。7、凝膠限度試驗5加樣結束后，用封口膜封口，輕輕混勻，防止產生氣泡，垂直放入細菌內毒素檢查專用干式恒溫儀中，在37℃±1℃保溫60分鐘±2分鐘后，觀察并記錄結果。注意在保溫和拿取試管過程應防止受到震動制成假陰性結果。7、凝膠限度試驗6結果判斷將試管從恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉180°時，假設管內形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(＋)；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實，變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(－)。假設陰性對照溶液的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液的平行管均為陽性，陽性對照溶液的平行管均為陽性，試驗有效。7、凝膠限度試驗結果判斷供試品2管均為(－)，應認為符合規定。如2管均為(＋)，應認為不符合規定；如2管中1管為(＋)，1管為(－)，按上述方法另取4支供試品管復試，假設所有平行管均為(-)，即認為符合規定。否那么判供試品為不符合規定。凝膠法限量檢查美國藥典和歐洲藥典溶液A和供試品陽性對照液B使用不超過MVD的供試品溶液……USP32:PrepareSolutionAandpositiveproductcontrolSolutionBusingadilutionnotgreaterthantheMVD……EP6.0:PreparesolutionAandsolutionB(positiveproductcontrol)usingadilutionnotgreaterthantheMVD……8、凝膠半定量試驗凝膠半定量試驗系通過確定反響終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。按下表制備溶液A、B、C、D。按照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。8、凝膠半定量試驗編號內毒素濃度/被加入內毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數所含內毒素的濃度平行管數A無/供試品溶液檢查用水1248————————2222B2λ/供試品溶液12λ2C2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ2222D無/檢查用水——————28、凝膠半定量試驗注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋不得超過MVD。B為2λ濃度標準內毒素的溶液A〔供試品陽性對照〕。C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列。D為陰性對照。8、凝膠半定量試驗結果判斷1、假設陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反響終點濃度的幾何平均值在λ～2λ之間，試驗有效。8、凝膠半定量試驗系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反響終點濃度，所有平行管反響終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度[按公式CE=antilg(∑X/2)]。如果檢測時采用的是供試品的稀釋液，那么計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘以稀釋倍數。8、凝膠半定量試驗如試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于λ〔如果檢驗的是稀釋過的供試品，那么記為小于λ乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數〕。如果供試品溶液的所有平行管均為陽性，應記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。8、凝膠半定量試驗假設內毒素濃度小于規定的限值，判供試品符合規定。假設內毒素濃度大于或等于規定的限值，判供試品不符合規定。細菌內毒素定量檢查法開展現狀我國2000版藥典細菌內毒素檢查法應用指導原那么正式列入，定量法在我國得到肯定、應用和推廣。2005版將2000年版的指導原那么合并入檢查法中，正式收載細菌內毒素定量檢測法〔光度測定法〕。分類終點濁度法濁度法光度測定法動態濁度法〔定量法〕終點顯色法顯色基質法動態顯色法濁度法原理：利用檢測鱟試劑與內毒素反響過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據內毒素與鱟試劑的反響機理，被激活的凝固酶切斷凝固蛋白原中特定位置的精氨酸肽鏈，形成凝固蛋白，產生濁度變化，用適當濁度儀進行定量分析的一種方法。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法是依據反響混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度〔吸光度或透光率〕之間存在著量化關系來測定內毒素含量的方法。動態濁度法是檢測反響混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反響時間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質法原理：利用檢測鱟試劑與內毒素反響過程中產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據被內毒素激活的凝固酶水解鱟三肽中精氨酸肽鏈，釋放出對硝基苯胺〔PNA)，用冰醋酸終止反響進行吸光度測定，或用游離的PNA和偶氮試劑反響，最終形成偶氮藍復合物顯色而進行比色測定的一種方法。根據檢測原理，分為終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法是依據反響混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反響混合物的色度到達某一預先設定的吸光度所需要的反響時間，或是檢測色度增長速度的方法。內毒素與鱟試劑的凝膠反響光密度OD時間〔分鐘〕不同濃度的內毒素反響曲線鱟試劑定量檢測內毒素原理檢測樣品原理檢測樣品的反應時間通過標準曲線反算濃度lgTlgClgClgTTxCx用系列稀釋的標準品與反應時間回歸標準曲線動態濁度法實驗方法