知識回顧基因中心法則DNA自我復制、RNA轉錄、蛋白質翻譯基因表達調控DNA、RNA、翻譯三個層次調控基因突變新性狀，物理、化學及轉座誘導

第九節

基因工程本節重點一、基因工程概念及原理二、原料與工具三、操作方法與步驟四、基因工程應用一、基因工程概念及原理1.基因工程又稱重組DNA技術，在生物體外，通過各種酶，將目的基因導入載體，形成重組DNA分子，并使其進入受體細胞進行表達，產生出人類所需要的基因產物。這種有目的應用分子克隆技術，人為的改造基因，改變生物的遺傳性狀的系列過程，總稱為基因工程。2.基因工程原理DNA是大多數生物的遺傳物質，由四種脫氧核苷酸組成。具有規則的雙螺旋結構。基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。遺傳信息的傳遞遵循中心法則。遺傳密碼具有通用性。二、原料與工具1.原料：目的基因基因庫PCR方法擴增人工合成（1）從基因庫中分離基因基因庫（library）：

是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構建基因庫。根據克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：

核基因庫、染色體庫、

cDNA庫、線粒體庫等。散彈槍法構建基因文庫

①

Southern雜交分析由英國Southern（1975）發明，將瓊脂糖中DNA轉移到尼龍膜進行DNA分子雜交分析的方法。篩選基因庫得到陽性克隆將限制性酶酶切與Southern雜交結合繪制限制性酶圖譜。分離方法②DNA芯片（DNAchips）

核酸分子雜交的原理和方法

半導體技術結合

形成的一門新技術。這一技術可使許多分子雜交反應同時進行。

（2）PCR擴增基因

聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）可以體外快速擴增DNA。美國Mullis（1986）發明（現代生物學發展史里程碑）。PCR儀離心機PCR反應三個步聚

（一個循環）：1.變性：94~95℃使模板DNA雙鏈變成單鏈；2.復性：50~70℃下，引物分別與

DNA單鏈互補配對；3.延伸：在引物的引導和Taq酶作用下，72℃下合成模板

DNA的互補鏈。

PCR反應通常有25~35個循環，一般可擴增5kb左右的片段。載體：

目的基因的擴增和運載工具，其作用將更多的目的基因帶入受體細胞，并使目的基因擴增和表達。按來源分：質粒載體、病毒載體等按作用分：克隆載體、表達載體、穿梭載體。2.工具載體的條件：①.

具有復制原點，能自我復制；②.

具多克隆位點（multiplecloning

site，MCS或polylinkerregion），

即有多種限制酶的切點；③.

選擇時的遺傳標記，如抗生素

基因；④.

易從宿主細胞中回收。pUC19質粒限制性核酸內切酶：又稱限制酶，切割DNA的一種酶。不同的限制酶，因識別序列不同，切割位點不同。工具酶限制酶的命名：生物學名+菌株名+菌株號，EcoRⅠ就是從R質粒的E.coli菌株分離而來。連接酶：類似“線”的功能，連接DNA片段。粘性末端平頭末端三、操作方法與步驟包括目的基因克隆過程和表達過程：1.基因克隆＊分離目的基因＊選擇合適克隆載體＊構建重組DNA分子＊導入感受態細胞，克隆目的基因＊篩選陽性克隆2.目的基因表達＊構建表達載體＊轉入受體細胞＊鑒定重組分子。農桿菌轉化法：

目前，基因工程研究發展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技術已廣泛用于工業、農業、畜牧業、醫學、法學等領域，為人類創造了巨大的財富。具有生長激素的轉基因鼠四、基因工程應用1.制藥

最早應用基因工程生產人的蛋白質的方法是在細菌中表達人的胰島素（1982）。

基因工程生產人的胰島素的方法如圖所示。

現已在細菌中生產10多種藥品，例如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。目前，酵母菌、植物懸浮細胞、植株和動物培養細胞均成功地應用于表達外源蛋白。基因工程應用大腸桿菌生產人類生長激素2.動植物性狀改良對照轉基因抗棉鈴蟲品種對照抗蟲稻轉基因花卉如：轉基因康乃馨、

矮牽牛等轉基因康乃馨（1999年開始在日本銷售）通過轉基因技術已育成稻米胚乳中含有胡蘿卜素的“黃金稻”轉基因發光魚（新加坡育成）轉賴氨酸基因“織女”3.人類遺傳疾病診斷和治療

利用重組DNA技術進行遺傳疾病診斷，是直接從

DNA即基因水平進行診斷

準確度高，速度快。如進行產前診斷，分