中國水稻科學(ChinJRiceSci),2014,28(3):223-228322DOI:10.3969/j.issn.1001G7216.2014.03.001水稻同源異型域轉錄因子OsHox9的反向遺傳學分析艾麗萍中奧高志超李政龍孫瓊琳欒維江*(天津師范大學生命科學學院/天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387;*通訊聯系人,EGmail:lwjzsq/163.com)ReverseGeneticsAnalysisoftheTranscriptionFactorOsHox9,aMemberofHomeoboxFamily，inRiceAILiGping,SHENAo,GAOZhiGchao,LIZhengGlong,SUNQiongGlin,LUANWeiGjiang*(CollegeofLifeScience,TianjinNormalUniversity/TianjinKeyLaboratoryofAnimalandPlantResistance,Tianjin300387,China;*Correspondingauthor,EGmail:lwjzsq@163.com)322AILiping,SHENAo,GAOZhichao,etal.ReversegeneticsanalysisofthetranscriptionfactorOsHox9,amemberofhomeoboxfamily,inrice.ChinJRiceSci,2014,28(3):223G228.Abstract:Thehomeoboxtranscriptionfactorsplayimportantrolesinthegrowthanddevelopmentoftheplants,involvedinregulationofcelldifferentiation,thearchitectureofmorphogenesisandresponsetoenvironmentalsignalsinplants.Tostudythefunctionofthesetranscriptionfactorsinrice,weconstructedRNAivectorsofOsHox9andanalyzedthefunctionofOsHox9bythereversegeneticsmethod．TheresultsshowedthattheheightandtillernumberofRNAitransgenicplantsweredecreasedincomparisonwithwildtypeplants．RealGtimePCRanalysisshowedthatOsHox9expressionlevelwasdownregulatedintransgenicplantswithphenotype.However,theexpressionlevelofOsHox9intransgenicplantswithoutphenotypewassimilartowildtypeplants,suggestingthatthephenotypesoftransgenicplantswerecausedbyRNAieffects．Inaddition,wealsoanalyzedtheexpressionpatternofOsHox9indifferentorgansofrice．TheresultsshowedthatOsHox9wasexpressedindifferentorgans,especiallydisplayedhighexpressionlevelinstemapicalmeristemsandyoungpanicles．ToinvestigatethesubcellularlocalizationofOsHox9,weconstructedthefusedvector35S::OsHox9GGFPtointroduceintoleavesoftobacco.ThetransientexpressionresultshowedOsHox9waslocalizedonthecellmembrane．Keywords:rice;OsHox9;RNAi;expressionanalysis艾麗萍,申奧,高志超，等.水稻同源異型域轉錄因子OsHox9的反向遺傳學分析.中國水稻科學,2014,28(3):223G228.摘要:同源異型域(Homeobox,HB)轉錄因子對于植物的生長發育具有重要的調控作用，主要涉及細胞分化、形態建成、內外環境信號應答等多個方面.為了研究該轉錄因子家族成員在水稻中的功能，構建了該家族成員OsHox9基因的RNAi表達載體，利用反向遺傳方法分析該基因的功能.與野生型對照植株相比,RNAi轉基因植株株高變矮，分蘗數減少.實時PCR表達分析表明OsHox9基因在有表型轉基因植株中的表達下調,但在沒有表型轉基因植株中OsHox9表達量與野生型植株差異不顯著，說明RNAi載體起到了干涉作用，轉基因植株的表型是由RNAi造成的.組織特異性表達分析表明OsGHox9在水稻的根、莖、葉、莖頂端分生組織及不同時期的幼穗中均有表達，但在莖頂端分生組織及幼穗中表達量較高.為了查明OsHox9的亞細胞定位，構建了。sHox9與綠色熒光蛋白GFP的融合載體并導入煙草葉片中進行瞬時表達，結果表明OsHox9定位于細胞膜上,在細胞膜上起作用.關鍵詞:水稻;OsHox9;RNA干涉;表達分析中圖分類號:Q755;S511032文獻標識碼:A文章編號：1001G7216(2014)03G0223G06同源異型域(Homeobox,HB)轉錄因子在動植物生長發育中起重要的作用.該轉錄因子包含一個高度保守的同源異型域(Homeodomain,HD),該結構域由60個保守的氨基酸組成[1].根據HD基序序列、位置、兩側序列同源性的差異以及HB中其他保守結構域的不同一般可將植物HB轉錄因子家族分為亮氨酸拉鏈同源異型域轉錄因子(HomeGodomain同源異型域(Homeobox,HB)轉錄因子在動植物生長發育中起重要的作用.該轉錄因子包含一個高度保守的同源異型域(Homeodomain,HD),該結構域由60個保守的氨基酸組成[1].根據HD基序序列、位置、兩側序列同源性的差異以及HB中其他保守結構域的不同一般可將植物HB轉錄因子家族分為亮氨酸拉鏈同源異型域轉錄因子(HomeGodomainGleucineGzipper,HDGZip)、Knotted相關同源異型域轉錄因子(knottedGlikehomeobox,KNOX)、植物指形同源異型域轉錄因子(planthomeodomainGfinger,PHDGFinger)、Bell同源異型域轉錄因子(bellhomeodomain,Bell)、Wuschel相關同源異型域轉錄因子(WuschelGrelatedhoGmeobox,WOX)和鋅指同源異型域轉錄因子(zincfingerGhomeodomain,ZFGHD)六大類.其中,HDGZip是近年來高等植物中發現的一類特有的轉錄因子[2G5]，它們在植物的各個組織器官中均有表達[6G9].HDGZip轉錄因子中,HD和LZ結構域的空間排列在真菌和動物中均沒有發現，由此可見,HDGZip在高等植物特有的發育過程中起著特殊的作用.HDGZip按編碼蛋白基因結構、基序、識別結合特異性DNA序列及生理功能的差異,可以分為四個亞家族(HDGZipl、HDGZipII、HDGZiplll、HDGZipW[4]),其中,HDGZiplll與I、II亞類存在很大的基因結構差異，通常識別的DNA序列為GTAAT(G/C)ATTAC[10].HDGZipIII在植物頂端分生組織的分化、生長素的極性運輸、維管組織的形成、近軸區域側部器官以及胚胎發育等過程中起重要調控作用[5,11].擬南芥中HDGZiplll亞家族有5個成員，分別為ATHB8、REV、CAN、PHB、PHV[5],這些成員在擬南芥發育進程中功能有所冗余,起著部分重疊或拮抗的功能[12].水稻中HDGZiplll亞家族有OsHox9、OsHox10、OsHox29、OsHox32、OsHox33五個成員,目前這些成員的功能仍不明確.本研究通過反向遺傳學方法對該家族中OsHox9成員的功能進行探索，并分析了其表達模式及具體作用部位，結果表明該基因在水稻生長發育過程中起重要作用.1材料與方法1.1材料本研究所用的野生型及相關轉基因植株的遺傳背景都為粳稻品種中花11(OryzasativaL.ssp.japonicacv.Zhonghua11),材料種植于天津市農業科學院試驗田，常規管理.1.2總RNA的提取與cDNA的合成>S>RNA用TRIzol(Invitrogen公司)試劑提取，用DNaseI(NEB公司)消化基因組DNA.2院處理后的RNA用MGMLV反轉錄酶(TaKaRa)反轉錄成cDNA.1.3載體構建RNAi載體的兩段干涉特異片段從15d大小水稻幼苗cDNA中PCR擴增獲得,正向片段由引

WlHox9F1,5'GCGTCggatccAATGATGATGGTTGGTCTGG3'IHox9R1,5'GTCGCggtaccCATCTATTCCAGTGCAAAGCG3，獲得,反向片段由引物IHox9F2:5'GCGTCgagctcCAATGATGATGGTTGGTCTGG3'IHox9R2,5'GCGGCactagtCATCTATTCCAGTGCAAAGCG3'(小寫字母為酶切位點)獲得.PCR條件如下：98°C下1min;98°C下10s,0，C下15s,72，C下40s,運行35個循環后72C下min.擴增的兩段干涉特異片段分別連入RNAi空載體pCAMBIA138中，酶切檢測和測序正確后電擊轉入農桿菌EHA105中,用農桿菌介導的遺傳轉化方法導入水稻中花11中[13].轉基因植株的分子檢測轉基因植株葉片DNA的提取參考盧揚江等方法[14]，略有改動[15].提取DNA作模板用潮霉素特異引物進行PCR擴增，引物序列分別為HygF,5'GCTTCTGCGGGCGATTTGTG3'HygR,5'GCAGCGTCTCCGACCTGATG3'.PCR條件如下：95C下1min;94C下30s,57C下30s,72C下30s,運行32個循環后72C下7min.RTGPCR分析在RNAi轉基因植株的表達分析中,RNA從水稻植株的葉片中提取;在水稻組織特異性表達分析中,RNA分別從水稻根、莖、葉、莖頂端分生組織、不同時期的幼穗中提取,反轉錄成cDNA后用于實時PCR和RTGPCR模板.引物序列均為OsHox9F:5'GGCTCGGAGAAGACAACAATGG3'OsHox9R：5'GGCACACACTCTTTACAGGCAG3'.實時PCR按照SYBRGreenPCR預混液(Tiangen,北京)試劑盒說明操作，并用2一△△Ct方法進行相對定量分析，重復3次.實時PCR擴增條件為95C下10min;95C下20s,60C下60s,40個循環.RTGPCR反應條件為95C下1min;94C下30s,56C下30s,72C下30s,運行32個循環后72C下7min.以水稻OsActin1內參相對定量，內參基因引物為OsActinF(5'GGACTCTGGTGATGGTGTCAGCG3')和OsActinR(5'GGGCTGGAAGAGGACCTCAGGG3').RTGPCR反應條件為95C下1min;94C下30s,56C下30s,72C下30s運行24個循環后72CT7min.OsHox9的亞細胞定位對于瞬時表達載體的構建,RNA從15d秧齡水稻幼苗莖頂端分生組織中提取,PCR擴增522艾麗萍等:水稻同源異型域轉錄因子OsHox9的反向遺傳學分析OsHox9完整ORF（去除終止密碼子），所用引物為FHox9F（5'GTTAgagctcTGGTGGTGGAGGAGGAGGATG3'）和FHox9R（5GACTgtcgacCACGAAGGACCAGTTGACGAG3f）（小寫字母為酶切位點序列）,PCR條件為98°C下30s;98°C下10s,59°C下15s,72°C下2min運行33個循環后72C下7min.擴增的特異片段克隆到空載體pCAMBIA35S::GFP中與GFP基因融合.測序鑒定正確的目的載體pCAMBIA35S::OsHox9GGFP注射煙草葉片稻同源異型域轉錄因子OsHox9的反向遺傳學分析2結果與分析2.1OsHox9RNAi表達載體的構建為了揭示OsHox9的功能，通過構建RNAi載體進行反向遺傳學分析（圖1GA）.441bpOsHox9特異干涉片段利用RTGPCR方法從水稻幼苗中獲得,通過凝膠電泳檢測發現目的條帶符合我們預期結果（圖1GB）.首先將正向特異干涉片段用BamHI和Kpn1與RNAi空載體pCAMBIA1381連接后獲得中間載體，再將反向特異干涉片段用SpeI和Sac1與獲得的中間載體連接獲得最終的pCAMBIA1381GOsHox9RNAi表達載體.連接好的重組載體進行酶切鑒定，按預期用BamHI和SacI可切出約1300bp的片段，酶切結果與預期相符（圖1GC），說明正向和反向目的片段已連接到空載體中;進一步用PCR方法驗證，結果表明每個克隆都擴增出了預期的441bp大小的目的條帶（圖1GD）,后經測序驗證表明特異干涉片段已正確連接到載體中，可以進行下一步的轉基因工作.2.2轉基因植株的PCR檢測將構建好的pCAMBIA1381GOsHox9RNAi載體用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉入水稻品種中花11中,共獲得了16個獨立株系的104株T0代RNAi轉基因植株.為了檢測構建的RNAi載體是否整合到水稻基因組中，我們提取這些轉基因植株的基因組DNA,用載體中特異的潮霉素基因引物，對T0代轉基因植株進行PCR檢測，結果表明104株轉基因植株中有81株為轉基因陽性植株（圖2）,陽性率約為78%.2.3轉基因植株的表型觀察及表達分析隨機種植7個獨立T0代RNAi轉基因陽性植株獲得T1代轉基因株系，觀察T1代轉基因株系表型發現7個株系中有3個株系株高變矮，分蘗數減少，并且抽穗日期有所推遲（圖3GA、B）.另外，轉基因植株的結實率也有所下降.為了驗證轉基因植株表型是否由RNAi干涉所致，從植株葉片中提取7A-RNAi載體結構;LB—TGDNA左邊界;p35S一花椰菜病毒35S啟動子;OsHox9—OsHox9正向特異干涉片段;AntiGOsHox9-OsHox9反向特異干涉片段;Loop—內含子序列;RB—TGDNA右邊界;B—OsHox9特異干涉片段PCR擴增.C—構建好的RNAi載體的酶切鑒定.D—RNAi載體PCR鑒定；1—3分別代表RNAi重組載體質粒;P—空載體質粒;M—DNA標記.A,RNAivector;LB,LeftborderofTGDNA;p35S,35Spromoterofcaulimovirus;OsHox9,ForwardinterferencefragmentofOsHox9;AntiGOsHox9,ReverseinterferencefragmentofOsHox9;Loop,Intronsequence;RB,RightborderofTGDNA;B,AmplificationofOsHox9interferencefragmentbyPCR;C,DetectionofenzymedigestioninRNAivector;D,DetectionofPCRinRNAivector;1—3,RNAirecombinantplasmid;P,Blankplasmid;M,DNAMarker.圖1RNAi載體的構建Fig.1.ConstructionofRNAivector.xotwqersrrrore8vae48￡1—14分別代表T0代RNAi轉基因植株;P—RNAi重組載體質粒;WT一野生型中花11;CK—ddH2O.1—14,RNAitransgenicplants(T0);P,RNAirecombinantplasmid;WT,WildtypeZhonghua11;CK,ddH2O.圖2T0代RNAi轉基因植株PCR檢測Fig.2.PCRdetectionoftheRNAitransgenicplantsofT0generation.TWV3Fig.2.PCRdetectionoftheRNAitransgenicplantsofT0generation.TWV3S￡￡r-(D<e一noEeqqxeM瀛051.r.o.o.o.oO.89.42.A一抽穗期;B一成熟期;WT一野生型中花11;RNAi一轉基因植株;C和D—RNAi轉基因植株RTGPCR和實時PCR表達分析;1—7分別代表7個獨立T1代RNAi轉基因植株.A,Headingstage;B—Maturestage;WT,WildtypeZhonghua11;RNAi,Transgenicplants;CandD,RTGPCRandrealGtimePCRanalysisofOsHox9expressioninRNAitransgenicplants;1—7,RNAitransgenicplantsofT1generationderivedfrom7independentT0generation.圖3RNAi轉基因植株的表型及表達分析Fig.3.AnalysisofphenotypeandexpressioninRNAitransgenicplants.個獨立株系轉基因植株的RNA，用實時定量PCR和RTGPCR的方法檢驗OsHox9表達量.結果表明OsHox9在有表型的4、6、7三個株系中表達量明顯降低（圖3GC），而在沒有表型或表型不明顯的轉基因株系（1,2,3,5）中表達量與野生型植株基本相當（圖3GC,D）,說明RNAi載體可以正常工作，RNAi轉基因植株的表型是由OsHox9表達受到十涉造成的.OsHox9基因在水稻中的組織特異性表達分析為了確定OsHox9在水稻不同組織器官中的表達，分別提取水稻莖頂端分生組織、不同時期幼穗、根、莖、葉的總RNA,反轉錄后用RTGPCR檢測其在水稻組織器官中的表達.結果表明OsHox9在水稻各個組織器官中均有表達，但表達量有差異.比較而言，在莖頂端分生組織及早期幼穗中表達量較高（圖4）,但在根和葉中表達量較低.OsHox9亞細胞定位分析同源異型域轉錄因子在植物中的功能復雜，為了解OsHox9在細胞中起作用的部位,我們構建了綠色熒光蛋白GFP與目的基因ORF融合載體.OsHox9完整ORF序列（去除終止密碼子序列）用RTGPCR方法從水稻莖頂端分生組織cDNA中獲得，測序驗證無誤后連入空載體pCAMBIA35S::GFP中與GFP讀碼框融合,載體經測序驗證后轉入農桿菌中,然后注射煙草進行瞬時表達.激光共聚焦顯微鏡觀察結果表明,pCAMBIA35S::

8wgqiqmQxoHaO1nMoAaOM—莖頂端分生組織;P1—8cm幼穗;P2—16cm幼穗;P3—25cm幼穗;R—根;S—8wgqiqmQxoHaO1nMoAaOM,Stemapicalmeristem;P1,8cmlongpanicle;P2,16cmlongpanicle;P3,25cmlongpanicle;R,Root;S,Stem;L,Leaf.圖4OsHox9在水稻不同器官中的表達Fig.4.ExpressionofOsHox9indifferentorgansofrice.OsHox9GGFP融合表達載體在煙草表皮細胞的細胞膜強烈表達（圖5GB）,另外,在氣孔細胞膜上也有強烈表達（圖5GC）,而在空載體對照pCAMGBIA35S::GFP中,GFP熒光在整個細胞內均有表達，沒有特異性（圖5GA）.表明OsHox9轉錄因子在細胞膜上起作用,另外其在氣孔中起作用說明OsHox9可能在水稻葉片中有很重要作用.3討論HDGZip轉錄因子在植物的發育進程中起重要的調控作用,有著復雜多樣的生物學功能.例如擬南芥AtHBG1轉錄因子調控葉片發育,AtHBG2調控葉片形態發育、下胚軸的延伸、植株開花時間等.AtHBG6調控細胞分裂與分化,AtHBG8調控維管組織的早期發育[4].胡蘿卜胚胎發育也受到HDGZip轉錄因子CHB1/2/3/4/5/6的調控，其中CHB2在胚胎早期發育中起作用.番茄VaHox1轉錄因子調控形成層細胞到韌皮部的分化[16].HDGZip轉錄因子還具有對外界環境脅迫信號的應答生理功能，例如擬南芥AtHBG2和AtHBG4調控光敏素相關的光控制的生物過程，如誘導葉綠素的合成適應弱光照等[17].722艾麗萍等:水稻同源異型域轉錄因子OsHox9的反向遺傳學分析水稻中轉錄因子HDGZiplll蛋白家族的功能還不明確，為了揭示其在水稻生長發育中的功能，我們構建了OsHox9的RNAi表達載體,導入水稻中獲得轉基因植株，利用反向遺傳學方法對HDGZiplll家族中的OsHox9基因功能進行了初步探索.結果表明OsHox9在功能敲除條件下影響水稻生長和發育，轉基因植株表現株高降低，生育期推遲.OsGHox9基因組織特異性表達表明其在莖頂端分生組織、幼穗中表達量較高,與前人研究結果一致[18].雖然OsHox9是一個轉錄因子,我們的研究結果表明其在細胞膜上發揮作用，尤其在葉片氣孔中有強烈的表達信號，說明該轉錄因子可能對于水稻葉片的發育及生長起重要作用，但該基因如何調控水稻的生長發育目前仍不清楚.下一步的研究,尤其是OsHox9轉錄因子與其下游基因的相互作用的研722艾麗萍等:水稻同源異型域轉錄因子OsHox9的反向遺傳學分析A一空載體pCAMBIA35S::GFP對照;B和C—pCAMBIA35S::OsHox9GGFP融合表達載體;B一煙草表皮細胞細胞膜上表達;C一氣孔細胞膜上表達.A,pCAMBIA35S::GFPemptyvetor;BandC,pCAMBIA35S::OsHox9GGFPfusionvector;B,GFPexpressedonthecellmembraneofepidermalcell;C,GFPexpressedonthecellmembraneofstoma.圖5OsHox9亞細胞定位Fig.5.SubcellularlocalizationanalysisofOsHox9.參考文獻：[1]JohannessonN,WangY,EngstromP.DNAGbindinganddimGerizationpreferencesofArabidopsishomeodomainGleucinezipGpertranscriptionfactorsinvitro.PlantMolBiol,2001,45(1):63G73.[2]RamachandranS,HiratsukaK,ChuaNH.TranscriptionfacGtorsinplantgrowthanddevelopment.CurrOpinGenetDev,1994,4(5):642G646.[3]MeijerAH,ScarpellaE,vanDijkEL,etal.TranscriptionalrepressionbyOshox1,anovelhomeodomainleucinezipperproteinfromrice.PlantJ,1997,11(2):263G276.[4]ChanRL,GagoGM,PalenaCM,etal.Homeoboxesinplantdevelopment.BiochimBiophysActa,1998,1442(1):1G19.[5]ArielFD,ManavellaPA,DezarCA,etal.ThetruestoryoftheHDGZipfamily.TrendsPlantSci,2007,12(9):419G426.[6]SodermanE,HjellstromM,FahlesonJ,etal.TheHDGZipgeneATHB6inArabidopsisisexpressedindevelopingleavGes,rootsandcarpelsandupGregulatedbywaterdeficitcondiGtions.PlantMolBiol,1999,40(6):1073G1083.[7]SodermanE,MattssonJ,EngstromP.TheArabidopsishoGmeoboxgeneATHBG7isinducedbywaterdeficitandbyabscisicacid.PlantJ,1996,10(2):375G381.[8]IngramGC,BoisnardGLorigC,DumasC,etal.ExpressionpatternsofgenesencodingHDGZipWhomeodomainproteinsdefinespecificdomainsinmaizeembryosandmeristems.PlantJ,2000,22(5):401G414.OhashiGItoK,DemuraT,FukudaH.PromotionoftranscriptaccumulationofnovelZinniaimmaturexylemGspecificHDGZiplllhomeoboxgenesbybrassinosteroids.PlantCellPhysiG

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