1、免疫親和柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定海洋生物中河豚毒素免疫親和柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定海洋生物中河豚毒素1引言河豚毒素Tetrdtxin，TTX是一種天然海洋生物神經(jīng)毒素，分布廣泛，主要存在于河豚魚中，圓尾鱟、藍(lán)環(huán)章魚、螺類等其它海洋生物中也有存在。河豚毒素毒性極強(qiáng)，食用0.5g就可致人死亡，其帶正電荷的胍基能伸入鈉通道的離子選擇過濾器，和通道內(nèi)壁上的游離羧基結(jié)合，阻礙Na+進(jìn)入，從而抑制神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，使人感覺神經(jīng)麻木，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡。我國每年都有因食帶有TTX的海洋生物而導(dǎo)致中毒的事件發(fā)生。鑒于河豚毒素的嚴(yán)重危害，有必要建立一種簡便、快速有效檢測河豚毒素的方法

2、。目前，河豚毒素的檢測方法有生物測定法、高效液相色譜法HPL、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法L-S及酶聯(lián)免疫法ELISA等。其中，生物測定法一般需要專門動物，適用性差，且操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力重復(fù)性差；酶聯(lián)免疫法雖特異性強(qiáng)，但酶聯(lián)免疫反響耗時長，操作難度較大；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，但現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法檢出限偏高，前處理復(fù)雜，且采用的固相萃取技術(shù)凈化樣品不理想、易受基質(zhì)干擾，回收率低。免疫親和柱IA是一種基于抗原抗體反響的新型層析柱，利用生物大分子具有對一本文由論文聯(lián)盟.Ll.搜集整理類生物大分子特異識別和可逆結(jié)合的特性制作而成，具有獨(dú)特的選擇專一性和良好的吸附凈化性能。目前，尚未見以免疫親和柱作為前處理凈化

3、手段檢測河豚毒素的相關(guān)報道，本實(shí)驗(yàn)基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性和準(zhǔn)確性，利用免疫親和柱的獨(dú)特選擇識別性，建立一種快速、簡便、高效測定海洋生物中河豚毒素的分析方法。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑AQUITY超高效液相色譜-質(zhì)譜儀QuattrPreierXE美國aters公司；S2漩渦混合器德國IKA公司；N-EVAP-112氮吹儀美國rganatin公司；entrifuge5810高速離心機(jī)德國Eppendrf公司；12通道固相萃取裝置美國Supel公司。TTX標(biāo)準(zhǔn)品純度98.0%，德國Dr.Ehrenstrfer公司；TTX免疫親和柱柱容量3L，北京華安麥科生物技術(shù)；乙腈、甲醇色譜純，德國erk

4、公司；乙酸銨、甲酸美國Siga公司；乙酸、Na2HP412H2、NaH2P42H2、Nal、NaH上海國藥集團(tuán)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。2.2溶液的配制TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取5.00gTTX標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%甲酸-乙腈11，V/V溶液溶解并定容至50L，4避光保存，保存期限為6個月；使用時逐級用0.1%甲酸-乙腈溶液11，V/V稀釋至100g/L。磷酸鹽緩沖液PBS：分別稱取Na2HP412H26.45g，NaH2P22H21.09g，Nal4.25g，用水溶解并定容至500L。2.3色譜及質(zhì)譜條件色譜柱：AQUITYUPLBEHAide柱502.1，1.7；樣品室溫度10；柱溫40；進(jìn)樣體積1

5、0L；流速0.3L/in；流動相A為含0.1%甲酸的5l/L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫：01.5in，5%80%A；1.53.0in，80%A；3.03.5in，80%5%A；3.55in，5%A。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描ESI+；檢測方式：多反響監(jiān)測R；毛細(xì)管電壓：3.0kV；離子源溫度：110；脫溶劑氣溫度：350；錐孔氣流量：50L/h；脫溶劑氣流量：600L/h；錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質(zhì)譜多反響監(jiān)測實(shí)驗(yàn)條件如表1所示。2.4樣品處理2.4.1樣品提取稱取已充分均質(zhì)樣品2.00g于50L具塞離心管中，參加10L含有1%乙酸的甲醇溶液，渦旋振蕩2in，60

6、水浴超聲提取15in，冷卻至室溫后，6000r/in離心5in。移取5L上清液至另一個50L離心管中，參加20LPBS溶液稀釋，用1l/LNaH調(diào)至pH78，待凈化。2.4.2免疫親和柱凈化取出免疫親和柱，待回至室溫，去掉親和柱堵頭，放出柱內(nèi)保存液后，上樣品液。上樣完畢后，用8L水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4L含有1%乙酸的甲醇溶液洗脫，搜集的洗脫液于60氮?dú)獯蹈桑?L流動相溶解并定容，經(jīng)0.22濾膜后供液相色譜-質(zhì)譜分析。3結(jié)果與討論3.1色譜與質(zhì)譜條件選擇TTX由于親水性和極性較強(qiáng)，在一般的反向色譜柱上不易保存，而AQUITYUPLBEHAide色譜柱作為專

7、用于強(qiáng)極性化合物分析的親水色譜柱，對TTX保存性強(qiáng)，且具有較好的色譜峰形，滿足TTX液相色譜分析的需要。乙酸銨溶液能促進(jìn)TTX胍電離，并為陽離子的形成提供了質(zhì)子來源，進(jìn)步TTX離子化效率；甲酸能通過調(diào)節(jié)流動相pH到達(dá)適宜的別離效果，改善色譜峰形。本實(shí)驗(yàn)研究比較了多組不同體積分?jǐn)?shù)甲酸及不同濃度乙酸銨溶液對色譜分析的影響。結(jié)果說明，以0.1%甲酸的5l/L乙酸銨溶液與乙腈為流動相具有良好的色譜別離效果，且峰形鋒利對稱。TTX分子構(gòu)造中具有帶正電荷的胍基，本實(shí)驗(yàn)選擇在正離子掃描形式下用蠕動泵以3.0g/L的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)展流動注射分析，對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)展優(yōu)化。通過一級質(zhì)譜掃描分析，得到TTX的分子離子

8、，調(diào)試選擇最正確錐孔電壓和毛細(xì)管電壓，其中+/z320豐度最高，從而可選擇離子/z320作為母離子進(jìn)展檢測，如圖1所示。對分析物離子進(jìn)展二級質(zhì)譜分析，獲取碎片離子信息，并對碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)展優(yōu)化，見表1。3.2提取試劑的選擇TTX是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，只溶于酸性水或有機(jī)溶液。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈和甲醇對TTX的提取效率。乙腈作為常用的提取試劑，提取效率較好，但毒性較大；考慮到甲醇能迅速穿透組織，沉淀蛋白質(zhì)，并具有脫水性，是提取TTX的良好試劑。為考察TTX提取所需的適宜酸度，通過添加不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸獲取不同酸度的甲醇，比較不同酸度甲醇下提取圖2提取試劑酸度對TTX提取效果的影響Fig

9、.2EffetfextratinreagentaiditynTTXextratin得到的5g/LTTX峰面積，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)提取試劑中乙酸體積分?jǐn)?shù)小于1%時，提獲得到的TTX峰面積隨乙酸的體積分?jǐn)?shù)增加而增大；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于1%后，峰面積根本保持不變，而過量的乙酸不利于調(diào)節(jié)樣品液pH值，因此選擇含1%乙酸甲醇作為TTX提取試劑。3.3免疫親和柱條件優(yōu)化免疫親和柱的親和結(jié)合作用與樣品液的pH值直接相關(guān)，不適宜的pH值會使親和作用減弱或破壞。本實(shí)驗(yàn)采用Hl和NaH調(diào)節(jié)樣品液pH值，通過比較不同pH值下TTX的回收率，考察不同pH值下免疫親和柱的親和作用才能，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)pH=78時，親和作

10、用才能最正確，TTX回收率最高；當(dāng)pH6.5或pH9時，親和才能明顯減弱，由此確定pH=78時為TTX免疫親和柱的最適宜pH值。當(dāng)使用8L水淋洗親和柱時，雜質(zhì)可根本除去，而TTX未被洗脫下來；TTX幾乎已完全洗脫，回收率也趨于穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)采用8L水作為淋洗液，4L含有1%乙酸甲醇作為洗脫液。本實(shí)驗(yàn)還比較了X柱、18柱、SX柱與免疫親和柱對海洋生物的凈化效果，并考察4種層析柱對TTX回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，免疫親和柱對海洋生物樣品的凈化效果最好，目的峰能與雜峰有效別離，且響應(yīng)強(qiáng)度高，回收率好，如圖4所示。3.4線性范圍和定量限用TTX標(biāo)準(zhǔn)使用液配制濃度為0.3，1.0，2.0，5.0，1

11、0.0和20.0g/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，峰面積-TTX濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=72.2835x+13.5344R2=0.9972，TTX在0.320.0g/L范圍內(nèi)線性良好。以3倍信噪比確定本方法的檢出限LD為0.1g/kg，以10倍信噪比確定本方法的定量限LQ為0.3g/kg，如圖5所示。本方法較文獻(xiàn)檢出限更低，靈敏度進(jìn)步了34倍，適用于海洋生物中TTX的檢測。圖410g/kg加標(biāo)陰性樣品經(jīng)免疫親和柱凈化后的R圖譜a.定量離子對；b.定性離子對3.5回收率和精細(xì)度準(zhǔn)確稱取2.00g陰性對蝦樣品，添加程度為0.30，1.50和5.00g/kg的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加程度平行測定6次，計(jì)算回收率和精細(xì)度，結(jié)果見表2。TTX在0.305.00g/kg添加程度的平均回收率88.7%102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏向?yàn)?.0%6.4%。3.6實(shí)際樣品分析采用本方法