1、時間：時間：2014-9-27一、背景知識介紹一、背景知識介紹二、凝膠電泳具體實驗操作二、凝膠電泳具體實驗操作三、應用三、應用一、背景知識介紹電泳（electrophoresis）：帶電物質在電場中向相反電極移動的現象 。電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。 自由界面電泳沒有固定支持介質，所以擴散和對流都比較強，影響分離效果。于是出現了固定支持介質的電泳，樣品在固定的介質中進行電泳過程，減少了擴散和對流等干擾作用。 凝膠作為支持介質的引入大大促進了電泳技術的發展，

2、使電泳技術成為分析蛋白質、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。電泳的基本原理： 在電場中，推動帶電質點運動的力（F）等于質點所帶凈電荷量（Q）與電場強度（E）的乘積，即FQE。質點的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對于一個球形質點，服從Stoke定律，即：F6r式中r為質點半徑，為介質粘度，為質點移動速度，當質點在電場中作穩定運動時：FF即QE6r 球形質點的遷移率，首先取決于自身狀態，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質粘度成反比。除了自身狀態的因素外，電泳體系中其它因素也影響質點的電泳遷移

3、率。電泳遷移率（m, electrophoretic mobility ）是指在單位電場強度（1V/cm）時帶電分子的遷移速度遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。 DNA分子在凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶。 為了獲得好的電泳結果，應盡量減少電荷效應，增加分子篩效應。常用的凝膠電泳有兩類 ：瓊脂糖凝膠電泳：分辨率稍低，適于較大分子 。聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨率高，適于較小分子。 凝膠電泳的檢測靈敏度 與凝膠的類型和密度

4、相關 瓊脂糖凝膠的檢測靈敏度在0.250Kb之間; 聚丙烯酰胺的檢測靈敏度在11000bp之間瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在 堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負電荷，在電場中通過凝膠介質向正極移動，不同DNA分子片段由于分子和構型不同，在電場中的泳動速率液不同。溴化乙 錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡合物，經紫外線照射后，可分出不同的區帶，達到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離,如下表所示:核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關

5、系 不同構型DNA的移動速度次序為：共價閉環DNA(covalently closed circular，簡稱cccDNA)直線DNA開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA(一般為球形)不能進入膠中，相對遷移率為0(Rm=O)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以 長軸方向前進(RmO)，由此可見，這3種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。 瓊脂糖凝膠電泳優點（ 1 ）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約占 98 % 99 %），近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳小，對樣品吸收吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。（

6、2 ）瓊脂糖呈透明狀，無紫外吸收，電泳后的樣品可直接用紫外檢測；電泳后區帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。（ 3 ）操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其裝載的樣品量大，回收DNA純度高。長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分離。 聚丙烯胺凝膠電泳優點：（1）分辨率高；（2）載樣量大； 1cm1mm的加樣孔加入10 g 分辨率不下降，而瓊脂糖0.5cm 1mm加樣孔加

7、入100-500ng的DNA分辨率下降。（3）回收DNA純度高；（4）機械強度高，韌性好。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其裝載的樣品量大，回收DNA純度高。長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分離。 （一）實驗材料和試劑實驗材料：實驗材料： PCR產物產物,植物基因組植物基因組DNA,質粒質粒DNA等；等；實驗試劑：實驗試劑： 電泳緩沖液；電泳緩沖液； 電泳載樣緩沖液；電泳載樣緩沖液； 電泳染料。電泳染料。 （二

8、）實驗儀器微波爐凝膠電泳槽凝膠成像系統（三）DNA的遷移速率決定因素 1 DNA分子的大小 雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數的常用對數近似成反比； 2 瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快； Separation Range Vs. % AgaroseLow Geling Agarose 4-6 0.02-0.4 3 DNA的構象 一般同一分子：超螺旋環狀線狀切口環狀。 4 凝膠和電泳緩沖液中的染料 如：溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。4.1 EB染料使用EB染色注意事項（1）EB被認為是一種強致癌物質（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸4.2 Gold

9、 view Gold view是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結合的親和力高，并且結合后，能夠極大增強熒光信號。 且現在的結果表明，Gold view沒有明顯的毒副作用。 5 所用的電壓 低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。 6 電泳緩沖液 常用的有TAE、TPE及TBETAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較 都是常用電泳緩沖液。三者相比：1）TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側將發生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對于高分子質量的DNA，TAE的分

10、辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。 二 凝膠電泳具體實驗操作包括拿到產物之后的處理到配膠、點樣、跑膠、切膠到膠回收等操作步驟。冷凍、離心冷凍、離心。 拿到產物之后，應先置于4冰箱冷凍，因為產物溫度高會影響跑膠的效率以及很可能造成產物的氣溶膠污染，待溫度降下來后，瞬時離心。配膠配膠。 瓊脂糖凝膠。根據產物的分子量的大小需配置不同濃度的膠。見下圖：瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度%可分辨的線性可分辨的線性DNA大小范圍大小范圍/（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00

11、.13 凝膠板有30ml、50ml、100ml三種，以制備50ml的0.1%的膠為例，于電子稱上稱取瓊脂糖0.5g，倒入250ml錐形瓶，用量筒量取50ml的1TAE緩沖液倒入錐形瓶，混勻，用錫箔紙蓋住瓶口，置于電磁爐里中高火加熱兩分鐘。同時將干凈的置膠板放好、梳子插好，并備好染色劑。3.染色和倒膠染色和倒膠。 染色劑用goldview，其分辨率較EB稍差，但安全性更高。使用時避免其接觸皮膚和眼睛。根據經驗30ml的膠加4.5L、50ml加7.5L、100ml加10L。待錐形瓶中凝膠溶液冷卻至60左右時（不燙手），將goldview加入其中，搖勻，然后將凝膠溶液倒入置膠板上。避免氣泡。 待膠凝

12、固后（約1530min），垂直拔出梳子，將膠放入電泳槽中，點樣孔靠近負極。電泳液液面應至少高出膠板表面12mm。4.加樣加樣。 取一只PE手套，鋪平。根據樣本個數將loading buffer點于手套上，一般每10L點810個，吸取6L樣本和loading buffer吹打34次混勻后按順序加入點樣孔（小孔）中，點樣時要預留出點marker的孔，一般maker點在兩邊緊鄰樣本的點樣孔中。 loading buffer的功能主要有兩個。第一、指示劑溴酚藍和二甲苯酚起到指示的作用，顯示電泳的進程，以便我們適時終止電泳；第二、里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE，從而沉降到點樣孔中，

13、防止樣品飄出點樣孔。5. 電泳電泳： 點完樣后，將膠擺正，蓋上電泳槽蓋，設好電壓電流以及跑膠時間，按啟動開始跑膠。一般電壓用5V/cm。一般等loading buffer中的溴酚藍跑到膠的2/3處，即可關閉電泳儀，將膠取出送至成像儀拍照分析。6. 膠回收：膠回收： 跑完膠后，如有需要，可做膠回收，首先是切膠，將膠放在紫外分析儀的平臺上，打開開關，在紫外下可以看到清楚的目的條帶，迅速用刀片將目的條帶切下，關閉電源，將目的條帶裝入已標記好并稱重過的1.5ml離心管中，再次稱重。然后可用TIANGEN的膠回收試劑盒進行DNA的回收。附1.常用電泳緩沖液配方：緩緩 沖沖 液液工工 作作 溶溶 液液貯貯

14、 存存 液（液（1000ml）Tris-乙酸 （TAE） 1 0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA50 242g Tris Na2EDTA2H2O 37.2g 57.1ml冰乙酸 定容至1L Tris-磷酸 （TPE）1 0.09mol/L Tris-磷酸 0.002mol/L EDTA10 108g Tris 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）Tris-硼酸 （TBE）0.5 0.045mol/L Tris-硼酸0.001mol/LEDTA5 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol

15、/L EDTA （pH8.0）附2.核酸電泳常見問題及解決方案：問題問題可能原因可能原因解決方法解決方法DNA Marker降解核酸酶污染每次吸取時更換滅菌槍頭，勿將電泳緩沖液帶入管中；用后密閉4C保存保存不當4C 或-20C保存，避免多次反復凍融；不可加熱DNA Marker無法正確分離瓊脂糖質量差使用質量可靠的瓊脂糖制膠電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液條帶黯淡核酸濃度過低增加上樣量核酸降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品DNA條帶被示蹤染料掩蓋提高上樣量；避免使用與目的片段遷移率相同的示蹤染料問題問題可能原因可能原因解決方法解決方法條帶模糊或彌散電泳緩沖液多次使用后失效更換緩沖液核酸部

16、分降解使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品核酸樣品純度差，含有DNA結合蛋白或高濃度的鹽份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質電壓過低，電泳時間過長根據凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當的電壓進行電泳染色時間過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散電泳結束后及時觀察、拍照條帶大小不正確核酸降解或形成聚合物加熱處理或重新制備樣品 DNA酶切Marker的cos位點復性電泳前65度加熱5分鐘，冰上冷卻5分鐘以后再上樣相同分子量的DNA片段由于結構或序列的差異而有不同的遷移率判斷DNA分子是否有特殊結構，如缺口、超螺旋、二聚體等；富含AT堿基的DNA遷移率比同分子量富含GC堿基的DNA片段慢梳子變形，點樣孔不在同一水平線上使用完好的梳子制膠問題問題可能原因可能原因解決方法解決方法條帶缺失DNA條帶分子量過大使用脈沖凝膠電泳分子量接近的DNA條帶沒有分開選擇適當的凝膠濃度進行電泳電泳緩沖液使用不當SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的DNA片段電泳時間過長或電壓過高，DNA走出凝膠縮短電泳時間，調整電壓電極插反，DNA走出凝膠正確連接電極方向問題問題可能原因可能原因解決方法解決方法帶型異常不同樣本的上