1、現代分子生物學實驗 原理與技術第一章 緒論第一節 基因操作技術1.基因操作技術 基因操作技術（重組DNA技術、基因工程）是在DNA水平上闡明生命現象的技術，包括DNA的“切”、“連”、“擴”等。 “切”指限制性內切核酸酶切割DNA。 “連”指用DNA連接酶連接兩個DNA片段。 “擴”是指目的DNA在宿主/載體系統中進行擴增。2.實驗方案（1）基因操作實驗的主要目的有三個： 分離目的基因，獲取DNA信息； 分析基因結構； 分析基因功能。（2）試驗流程設計首先，應確定使用怎樣的研究方案；其次，根據試驗規模和研究室情況；最后，根據研究人員生活規律確定試驗時間。3.實驗方法 在設計實驗方法時應考慮 能

2、否達到實驗目的； 是否符合實驗室現狀； 是否符合自己的喜好。 實驗方法精度愛好實驗目的經費預算實驗周期儀器性能準確性速度確定實驗方法時應考慮的因素4.實驗遵循的原則忠于實驗流程 設平行對照實驗關注實驗要點 準確的試劑用量準備充足的實驗材料 數據整理注意：第一次實驗成功，第二次實驗馬虎。實驗精度：必須嚴格按照實驗流程進行的操作； 較嚴格的實驗操作，允許的變動； 允許20%變動的實驗操作； 不需要特別注意的實驗操作。酶促反應不順利時，若加入更多的酶或DNA，結果會 越來越糟。不設平行對照實驗往往是實驗失敗的原因。樣本標記的零亂也往往是實驗失敗的重要原因。5.實驗材料的準備購買利用公共服務機構接受饋

3、贈 寫求助信要注意： 你需要什么？ 及時、真實的將相關信息告訴對方，不能隱瞞。 通常向論文通訊作者尋求幫助。 寫信的稿紙是印有單位標志、名稱、電話號碼等信息的公函紙。第二節 實驗室規則與安全實驗室規則 保持肅靜 保持整潔 嚴格操作 注意節約 保證安全實驗室常識使用貴重儀器如分析天平、分光光度劑、離心 機等倍加愛護，使用前熟知使用方法，使用時 嚴格遵守操作規程，發生故障時，立即關機。凡揮發性、有煙霧、有毒和有氣味的實驗，均 應在通風柜內進行。配制試劑時，應對試劑純度、結構式、分子質量等 特性熟悉，做到“有的放矢”。量瓶是量器，不要用量瓶做容器。洗凈器皿應倒置架上，使其自然風干。實驗室安全實驗室生

4、物安全通用要求查看了解電閘、水閥煤氣總閥門所在處，離開實驗室檢 查是否關好。使用電器設備時嚴防觸電。使用高溫高壓鍋滅菌時不得離人。使用可燃物，特別是易燃物，應特別小心。凡使用腐蝕性試劑，必須謹慎操作，防止濺出。廢液特別是強酸強堿，應稀釋后倒入水池。有毒物品應按照實驗室規定辦理審批手續后方可領取，使用時嚴格操作，用后妥善處理。實驗室急救觸電 關閉電源； 用干木棍將導線與被害者分開； 將被害者移至木板上，與地面分離； 急救者必須做好觸電安全措施，手腳必須絕緣。火災 隔絕氧氣 起火物與水相容：水、濕布、沙土、滅火器等 起火物與水不相容：不可用水燙傷 乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染玻璃割傷或

5、其他器械損傷 清理傷口，硼酸水洗凈，涂碘酒，包扎灼傷皮膚 強堿：大量清水稀釋，涂5%硼酸或2%乙酸 強酸、溴：大量清水稀釋，5%NaHCO3或5%氨水煤氣中毒 呼吸新鮮空氣思考題：什么是DNA重組技術？其實驗的主要目的是 什么？答案試分析有些人工作很辛苦，但總得不出理想實驗結 果的原因。答案如何獲得你需要的實驗材料（特別是未商品化的材 料）？答案什么是實驗室生物安全通用要求（GB 1948 9-2004）？據此生物學實驗室可分幾級？答案實驗室發生火災時該如何處理？燙傷、灼傷時該如 何處理？答案如何處理對環境有污染的試劑？答案第二章 儀器操作與溶液配制 第一節 常用器皿與儀器1、塑料制品Eppe

6、ndrof 管2、微量移液器（槍）使用方法調節時，自大到小。由小值調到大值時，應多調1/3圈，再反調至設定值。3、恒溫水浴鍋 多用于酶促反應，將Eppendrof管插入浮漂中進行反應。4、小型離心機 離心甩干是指短時間（13s）的離心操作，目的是使附著于管壁的液體沉入管底。5、離心干燥機目的是使DNA樣品快速干燥。6、旋渦混合器利用不對稱的旋轉將管內液體混勻。7、振蕩器 攪拌離心管內液體，加速難容物溶解，清洗浸泡于溶液中的不潔器皿。8、真空泵 利用真空吸走液體，作用與離心干燥機或凝膠干燥機類似。9、紫外發光裝置防護板（貼有起保護作用的保鮮膜）過濾板 紫外線可分為短波、中波、長波等類型，短波光線

7、強，對DNA損傷大。實驗室一般使用中波，使用時應戴上防護眼鏡。因燈管和過濾板有使用壽命，用完后及時關閉。10、一次性手套11、紙巾防止危險試劑沾到手上。防止試劑受到污染。 吸走殘余液體，一般衛生紙就可以。 擦拭實驗用品（如玻璃板）時，要用專用、不帶毛屑的面巾紙。第二節 溶液1、實驗用水一蒸水：多用于大腸桿菌培養基的制備、電泳緩沖液的配制、器皿的漂洗的實驗。二蒸水：用于生物化學及組織培養實驗。2、儲液3、試劑稱量精度一般稱量精度為3位有效數字。 4、試劑滅菌 不可高溫高壓滅菌的試劑有： 遇熱易分解的試劑 易揮發的試劑 有機溶劑 腐蝕性、刺激性強的試劑。問題：1、如何正確使用微量移液器？使用中應特

8、別注意哪些事項？2、如何改變微量移液器的移液量？應自大調到小，還是自小調到大？為什么？答案3、哪些試劑需要高溫高壓滅菌？哪些試劑不能采用高溫高壓滅菌？對于不能采用高溫高壓方式滅菌的試劑如何滅菌？滅菌后試劑如何保存？是否需要分裝？答案4、分子生物學實驗中，哪些簡易儀器或裝置可以替代真空泵的作用？答案5、分子生物學實驗中，哪些溶液可以用旋渦混合器混勻？為什么？6、配制培養基時，通常使用哪種級別的水？為什么？答案第三章 大腸桿菌培養與保存準備1）制作平板（稱試劑、溶解、滅菌）2）清潔超凈工作臺3）配制液體培養基培養平板培養保存穿刺培養 液體小量培養（制作初始菌）DNA擴增甘油保存液體大量培養蛋白質表

9、達第一節 培養前準備1、大腸桿菌菌株 主要來自K12，根據菌體表面糖蛋白成分（O抗原、H抗原、K抗原等）分類。2、培養大腸桿菌所需的物品微量移液器液體培養基槍尖盒1）操作臺油性記號筆、小木棒、70%乙醇、涂布棒、接種環、煤氣燈、牙簽抗生素（-20保存）平板（蓋子朝上），保持干燥2）滅菌方法 高溫高壓滅菌（培養基、試劑、槍尖、小木棒、 牙簽等） 干熱滅菌（玻璃器皿及金屬器皿） 火焰滅菌（試管瓶口、接種環等） 紫外線滅菌（器械及培養基） 乙醇滅菌（實驗人員手、器械、操作臺）3）接種工具接種環用于液體培養基的接種及平板劃線。小木棒用于從平板向液體轉接細菌。牙簽用于從菌落中挑選需要的單菌落。涂布棒用于

10、向平板上涂布液體菌體。固體液體涂布棒小木棒牙簽3、培養基種類1）液體培養基 用于大量繁殖菌株以提取質粒DNA或表達的目的蛋白質。2）固體培養基 目的是使菌落增殖到一定大小，以獲取質粒斑或分離出單菌落。3）抗生素 配制：A無菌水溶解抗生素，吸入注射器針筒內。 B注射器嘴上安裝微量過濾器（過濾滅菌）。 C按每份1ml量分裝到Eppendorf管中， 保存于-20冰箱。使用：在接種前加入到液體培養基中，在配制固體 培養基時，待滅菌后加入抗生素。4、培養基的配制 1)液體培養基的配制小體積LB培養基的配制（2ml為例） 材料： 試管及瓶塞 藥匙 1L燒杯 攪拌器及攪拌轉子 試劑 步驟：胰蛋白酶10g

11、酵母提取物5g 1L燒杯 NaCl 10g加雙蒸水至刻度，用攪拌器混合均勻。用分裝器分裝至試管，每份2ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。大體積LB培養基的配制（800ml為例） 材料：藥匙 2L三角瓶 鋁箔紙 電動攪拌器及攪拌轉子 試劑 步驟：胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶 NaCl 8g加雙蒸水至800ml，混合均勻。高溫高壓滅菌，室溫保存。2)制作平板 材料：煤氣燈或酒精燈 水平臺面 1L三角瓶 鋁箔紙 直徑9cm的培養基 藥匙 試劑 瓊脂粉 步驟：胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶 NaCl 8g 瓊脂粉鋁箔紙封口，混勻，滅菌。待冷卻至60左右，分裝至培養皿。水平臺上凝固。倒置塑料袋

12、中4保存。注意：1、若需要加入抗生素，待冷卻至60 ，分裝前加入。2、直徑9cm的平皿，每皿25ml為宜。3、盡量縮短平皿開蓋時間，分裝的培養基很快凝固，因此操作要快。4、凝結在蓋上的水珠可能至污染，故倒轉存放。5、氨芐青霉素易失活，添加后的平皿應在數周內使用。第二節 大腸桿菌培養1.無菌操作前用70%乙醇消毒臺面。2.離酒精燈較近距離進行無菌操作。3.開蓋前和開蓋后用酒精燈灼燒瓶口2至3次。4.瓶口傾斜，不得垂直向上。5.使用平皿時盡量去除凝結在蓋子上的水珠，并不 得混淆蓋子。1、培養 1）小量液體培養 材料：接種針或小木棒 煤氣燈 搖床 2mlLB液體培養基 長有細菌的平皿 步驟：用接種針

13、接種 燒紅接種針的鉑金絲 輕觸平皿邊緣 挑起一個菌落 灼燒試管口，開蓋 將鉑金絲伸進液體培養基 37震蕩過夜 用小木棒接種 灼燒瓶口，取一根木棒 木棒挑起單菌落 同上2)大量液體培養基材料：煤氣燈 搖床 少量初始菌 8mlLB液體培養基步驟：小量培養數小時至過夜。 稍微打開盛有大體積培養液的三角瓶瓶蓋，灼燒瓶口。 打開有初始培養菌的試管口，灼燒，將初始培養菌轉入大量培養基中，蓋上蓋子，再灼燒瓶口。 37震蕩過夜。3）菌落測定在煤氣燈旁用微量移液器吸培養液，轉至Eppendrof管。打開分光光度計，調整波長至600nm。吸取未接菌的培養基至比色杯中，調整光吸收值為零。取Eppendrof管內的菌

14、液于比色杯中，測A600值。4）平板培養 劃線培養 材料：接種針、煤氣燈或酒精燈、新的LA平板、菌誘導期對數生長期平臺期死亡期結果：A =0.21.0時為指數生長期，A 1.0為平臺期。A =1.0為10 個/ml。8600600600步驟：用煤氣燈將接種針燒紅，輕觸平板一側，冷卻。用鉑金絲挑去平板上的單菌落，在培養基表面劃線。再灼燒鉑金絲，冷卻。與前面所劃線的一部分交叉劃線，以減少菌數。重復上步驟。37倒置培養過夜。第三節 大腸桿菌菌株保存1、平板保存 材料：新平板、圓形標簽紙、牙簽、封口膜或膠帶、長有大腸桿菌的初始平皿 步驟：在平板底部貼標簽，做標記。 用牙簽挑單菌落，接種到平板。 37過

15、夜后4保存。涂布培養 材料：涂布棒、新的平板、酒精燈或煤氣燈、菌液 步驟：將平板翻轉過來，置于蓋上，50干燥20至 30分鐘。 取100ul菌液，滴于平板上。 用涂布棒涂布均勻。 37倒置過夜。3、穿刺保存 材料：含0.7%瓊脂的LB培養基、鉑金絲、封口膜、玻璃瓶。 步驟：玻璃瓶內裝2/3培養基，滅菌，冷卻。 接種針火焰滅菌，在培養基中冷卻。 挑取單菌落后刺入培養基底部。 37度下培養12至18小時。 蓋緊瓶蓋，封口膜封口，室溫避光保存。2、甘油管保存 材料：2ml凍存管、滅菌的80%甘油、封口膜、菌液 步驟：過夜培養2ml菌液后，取1ml至凍存管。 加入200ul 80%甘油，混勻。 擰緊管

16、帽，用封口膜封口，保存于-70 或-20 。問題：1、用于基因克隆的大腸桿菌菌株主要有哪些？它們各自有什么主要特征？2、配制氨芐青霉素等抗生素時是否需要滅菌？如何滅菌?3、在進行大腸桿菌培養時，何時需要大量培養？何時需要小量培養？4、在大腸桿菌培養過程中，應注意哪些問題？5、當用平板培養大腸桿菌時，培養皿必須倒置，為什么？6、大腸桿菌的保存方法主要有哪些？第四章 基因操作中的酶學反應第一節 常用酶的保存注意：1、常規儲存于-20 ，也有4或8 。2、儲存的冰箱不能選用自動除霜類。3、不與通常樣品保存在同一冰箱。4、盡可能在短時間內完成全部操作。5、直接在冰箱內吸取需要的酶量。6、可用冰盒或金屬

17、制的冰空盛裝Eppendrof管，以便在冰箱之外吸取酶液。第二節 限制性內切核酸酶1、定義：是一類識別DNA上38個特異核苷酸序列，并產生切割反應的內切核酸酶的總稱。2、修飾酶：與限制性內切核酸酶識別的DNA序列相同，產生修飾反應的酶叫修飾酶，主要是甲基化酶。3、限制-修飾系統：限制性內切核酸酶對病毒等外來DNA起切割反應，但自身基因組DNA因修飾酶的修飾作用而不能被切割，這種防御機制叫1、識別序列 型限制性內切核酸酶的識別序列長度通常為48個核苷酸，對數具有對稱的回文結構。識別序列越長，其序列在DNA中出現的概率就越低。4、限制性內切酶的命名 EcoR E代表Escherichia屬 co代

18、表coli 種 R代表RY13株 用羅馬數字區別不同特異性的酶2、DNA片段的末端結構如如EcoR切割后產生切割后產生5粘性末端：粘性末端：Pst切割后產生切割后產生3粘性末端：粘性末端： 有一些酶沿對稱軸切斷有一些酶沿對稱軸切斷DNA，產生平，產生平端或鈍端（端或鈍端（Blunt end）, 如如Sma：3、反應條件添加緩沖液濃度：10儲液反應最適溫度：37 第三節 限制性內切核酸酶消化DNA實驗1、單個酶的切割反應材料: 37恒溫水浴箱 pBlueScriptSK （DNA） 雙蒸水 EcoR 10H添加緩沖液步驟：按以下順序混合試劑： 雙蒸水 13uL DNA 4uL 10H緩沖液 2uL EcoR 1uL 混勻。 37保溫1小時。+確認酶是否切完全（取14uL進行瓊脂糖凝膠電泳）。剩余的反應液用于以后的實驗。本實驗