1、PURB在氨基酸調(diào)節(jié)BMECs乳合成中的作用和分子機(jī)理哺乳動物乳腺組織在哺育下一代時(shí)分泌乳汁為其成長提供營養(yǎng)以及免疫保護(hù) , 乳汁中的主要成分包括乳蛋白、 乳脂肪、乳糖等 , 牛乳也是人類生活中必不可少的優(yōu)質(zhì)食品。 乳合成相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、 調(diào)控乳合成的關(guān)鍵信號分子及其作用機(jī)制是畜牧學(xué)亦是生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容。PURB是 Pur 蛋白家族中成員 ,Pur 家族蛋白可以形成同型和異型復(fù)合物, 并且特異性地以高親和力結(jié)合富含嘌呤的ssDNA(有義或反義 ) 或 RNA。它們優(yōu)先結(jié)合含有 GGN(N不是 G)重復(fù)序列。本研究前期發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍彼?Met) 刺激時(shí)牛乳腺上皮細(xì)胞 (BMECs)PURB

2、表達(dá)量顯著增加 , 提示 PURB作為轉(zhuǎn)錄因子可能對BMECs的乳的合成起調(diào)控作用。目前,國際上有關(guān) PURB的功能和作用機(jī)制的研究較少, 尚無研究揭示 PURB對 BMEC乳合成是否發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)擬揭示 PURB在氨基酸促進(jìn) BMECs乳蛋白和乳脂肪合成中的作用及其分子機(jī)理。本研究通過組織塊法培養(yǎng)和純化BMECs,得到的原代 BMECs進(jìn)行傳代培養(yǎng) ,-80 凍存?zhèn)溆谩５怪蔑@微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長速度, 免疫熒光 (IF) 法鑒定細(xì)胞的純度 :檢測細(xì)胞中 - 酪蛋白 ( -casein) 和角蛋白 18(Cytokeratin 18)的表達(dá)。在培養(yǎng)液中添加 0.6 mmol/L Met或

3、 0.6 mmol/L Leu,qRT-PCR 和 western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 -casein 和 -casein表達(dá)量顯著提高。脂滴實(shí)驗(yàn)結(jié)果與甘油三酯(TG) 檢測實(shí)驗(yàn)表明 ,Met 和 Leu 能夠顯著促進(jìn) BMECs乳脂肪的合成。通過以上實(shí)驗(yàn)成功地建立了氨基酸調(diào)節(jié)乳合成的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型。qRT-PCR和 western blotting結(jié)果表明 PURB蛋白和 mRNA的表達(dá)量在 Met和 Leu 作用時(shí)顯著上升。IF 檢測 PURB的亞細(xì)胞定位 , 顯示 PURB定位在胞核中 ,Met 、Leu 處理增強(qiáng) PURB在胞核中的定位。這些結(jié)果表明 ,Met 和 Leu

4、能夠顯著促進(jìn) BMECs中 PURB的表達(dá)和核定位 , 提示在 Met 和 Leu 上調(diào)乳蛋白和乳脂肪合成的過程中,PURB可能是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。利用重組質(zhì)粒和siRNA 對 PURB基因進(jìn)行過表達(dá)和干擾。PURB基因過表達(dá)時(shí) ,PURB、-casein和 -casein表達(dá)量顯著提高 ,TG 分泌和脂滴的合成顯著提高 ,mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平也顯著提高 ;PURB基因干擾時(shí) ,PURB、-casein及 -casein 表達(dá)量顯著降低 ,TG 分泌和脂滴的合成顯著降低 ,mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平也顯著降低。 以上研究結(jié)果表明 ,PURB具有正向調(diào)節(jié)

5、mTOR和 SREBP-1c信號分子從而促進(jìn)乳蛋白和乳脂肪合成的作用。為了探究 PURB接受 Met 和 Leu 刺激從而調(diào)節(jié)乳合成的分子機(jī)制, 應(yīng)用 PI3K抑制劑沃曼青 (wortmannin) 抑制 PI3K 信號通路。 Western blotting分析表明PI3K 抑制完全阻斷了2 種氨基酸對 PURB表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)果表明 Met 和 Leu 通過 PI3K 途徑促進(jìn) PURB蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步探究 PURB是否介導(dǎo) Met 和 Leu 調(diào)節(jié) mTOR和 SREBP-1c信號分子 , 細(xì)胞添加 Met 或 Leu 時(shí)同時(shí)轉(zhuǎn)染 PURB siRNA。Western blottin

6、g分析表明 PI3K 抑制完全阻斷了兩種氨基酸對mTOR磷酸化和 SREBP-1c蛋白水平的促進(jìn)作用。結(jié)果表明PURB介導(dǎo) Met 和 Leu 調(diào)節(jié) mTOR和 SREBP-1c信號途徑。采用染色質(zhì)免疫共沉淀 (ChIP)-PCR 和 ChIP-qPCR鑒定 PURB與 mTOR、SREBP-1c基因的啟動子 (-1-2 000bp)可能發(fā)生結(jié)合的位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PURB與mTOR、SREBP-1c基因的啟動子各存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-qPCR結(jié)果顯示 ,Met 和 Leu 刺激促進(jìn) PURB與靶基因啟動子的結(jié)合。 PURB基因過表達(dá)和干擾發(fā)現(xiàn)PURB正向調(diào)節(jié) mTOR和 SREBP-1c的 mRNA水平。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Met 和 Leu 刺激 PURB表達(dá)并促進(jìn)與 PURB與 mTOR、SREBP-1c的基因啟動子結(jié)合 , 啟動基因轉(zhuǎn)錄。已有研究提示PURB在基因轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用 , 但與許多其他轉(zhuǎn)錄因子相比, 國際上發(fā)表的結(jié)果較少。本研究發(fā)現(xiàn)在 BMECs中,PURB是牛乳腺細(xì)胞中乳蛋白和乳脂肪合成的正向調(diào)控因子。 PURB位于細(xì)胞核 , 氨基酸 (Met 和 Leu) 通過 PI3K 信號途徑促進(jìn) PURB表達(dá)。PURB可以與 mTOR和 SREBP-1c基因啟動子結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,Met 和 Leu 刺激這種結(jié)合。 PURB介導(dǎo) Met 和 L