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35DB35/T1992—2021番鴨細小病毒和鵝細小病毒雙重實時熒光定量PCR鑒別診斷技術Diagnostictechniqueofduplexreal-timefluorescentPCRforthedetectionofmuscovyduckparvovirusandgooseparvovirus福建省市場監督管理局發布I 8 91NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運3.13.2融解（解鏈）溫度meltingtemp核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，并在PCR反應體系中加入過量雙鏈嵌合熒光染料，熒光染料非特異性地摻入脫氧核糖核酸通過重新加熱擴增產物（反應溫度逐漸升高使結合了熒光染料分子的雙鏈DNA解離或“融解”鏈DNA，熒光強度發生顯著變化，形成一幅融解曲線圖。由于上述兩個特異性片段的Tm值不同，造成不同的PCR產物融解曲線特性不一樣（出現峰值所對應的溫度不同），通過分析擴增后融解曲線，可單、直接地判斷實時熒光定量PCR反應產物的目的基因片2）：5.6Tris-鹽酸飽和酚（pH7.6）。5.7酚-氯仿-異戊醇混合液（25：24：1在一滅菌棕色瓶中按25：24：15.13MDPV和GPV雙重實時熒光定量PCR檢測用上、下游引物序織勻漿，反復凍融3次，經2000r/min離心20min，取上清液分裝，于-20℃凍存待檢。離心管中，振蕩器上充分振蕩30s，然后將樣品懸液轉入新的1.5mL滅菌離心管中，于-20℃凍存待3按下列步驟完成DNA的提取，也可選擇市售商品化DNA提取試劑盒或全自動核酸抽提儀及配套核酸）；d)加等量的酚-氯仿-異戊醇（25:2），水溶解沉淀，-20℃保存備用。在檢測區使用熒光定量PCR試劑盒配制MDPV和GPV雙重實時熒光定量PCR檢測反應體系n管（n為第三階段，融解60℃~95℃,在擴增反應結束后，添加融解步驟，生成融解曲線。試驗結束后讀取檢測結果，Ct值的閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴增曲線的8.2質控標準48.3結果描述及判定50.01mol/L（pH7.2）磷酸鹽緩沖液磷酸二氫鈉水溶液（NaH2PO4?H2O）27.磷酸氫二鈉水溶液（Na2HPO4?12H2O）71.6MDPV和GPV雙重實時熒光定量PCR鑒別檢測方法所用引物見表B.1。5'-TAATGGTGGCAGGAATG7MDPV和GPV雙重實時熒光定量PCR鑒別檢測反應體系組分見表C.1。SYBRGreen熒光定量PCR酶混合物（aSYBRGreen熒光定量PCR試劑盒內提供，內含DNA聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucl），8

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