傳統發酵技術的應用1.發酵概念：發酵是指人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過微生物的代謝轉化為人類所需要的產物的過程；發酵原理；不同的微生物具有產生不同代謝產物的能力，因此利用它們既可以生產出人們所需要的多2.傳統發酵技術概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的面團、鹵汁等發酵物中的微生物進行發酵、制作食品的技術；傳統發酵技術特點：以混合菌種的固體發酵及半固體發酵為主，通常是家庭式或作坊式的；使用酵母制作饅頭不屬于傳統發酵技術，使用前一次發酵保存下來的面團進行的才算；例如直接利用空氣中毛霉孢子制作腐乳屬于傳統發酵技術，若直接接種毛霉，則不屬于；豆腐發酵制作腐乳的過程中，參與的微生物有酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉；豆腐發酵的原理：毛霉等微生物能產生蛋白酶和脂肪酶等，經過微生物的發酵，豆腐中的蛋白質被分解為小分子的肽和氨基酸，脂肪分解為甘油和脂肪酸，味道鮮美，易于消化吸收；常見利用傳統發酵技術制作的食品還有醬、醬油、醋、泡菜、豆豉等。3.乳酸發酵微生物—乳酸菌①厭氧細菌(原核),代謝類型為異養厭氧型，在無氧的情況下能將葡萄糖分解成乳酸②發酵原理(反應簡式)③生產應用：可用于乳制品的發酵、泡菜的腌制等④分布：空氣、土壤、植物體表、人或動物的腸道內；⑤常見類型：乳酸鏈球菌和乳酸桿菌⑥制作泡菜(1)參與發酵的主要微生物及來源：植物體表面天然的乳酸菌(2)發酵原理：①利用植物體表面天然的乳酸菌來進行發酵；②發酵期間，乳酸會不斷積累，當它的質量百分比為0.4%-0.8%時，泡菜的口味、品質最佳；③相關反應式(同上)(3)發酵條件：適宜的溫度、嚴格控制厭氧條件(4)步驟：配制鹽水→原料處理、蔬菜裝壇→加入鹽水→封壇發酵(5)實驗分析①鹽的作用：調味，抑制其他微生物生長②鹽水濃度為質量百分比；5%-20%;鹽水濃度要適宜的原因：過高，乳酸發酵將受抑制；過低，雜菌易繁殖，導致泡菜變質③鹽水煮沸的目的：殺菌，去除水中的溶解氧④鹽水冷卻后使用的目的：為了不影響乳酸菌的生命活動⑤泡菜壇子使用之前要檢查密封性的目的：給泡菜壇內創造無氧環境，嚴格控制厭氧條件⑥用水密封泡菜壇的目的：給泡菜壇內創造無氧環境，嚴格控制厭氧條件⑦泡菜制作過程中，是否只有乳酸菌起作用?不是，還有一些酵母菌和大腸桿菌⑧蔬菜應新鮮的原因：若不新鮮，蔬菜中的亞硝酸鹽含量會升高⑨泡菜壇應裝至八成滿原因：防止由于產生CO2而導致發酵液溢出壇外(初期大腸桿酵母菌會產生)防止因裝太滿使鹽水未完全淹沒菜料而導致菜料變質腐爛；(6)為什么含有抗生素的牛奶不易發酵為酸奶?牛奶發酵為酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能夠殺死或抑制乳酸菌(7)發酵中為什么乳酸菌會逐漸成為優勢菌種：乳酸菌比其他種類微生物更耐酸；發酵中pH下降，導致其他種類的微生物的生命活動受到抑制；(8)乳酸發酵過程中乳酸菌數量變化先增多后減少，乳酸含量變化持續增多，最后保持穩定，亞硝酸鹽含量變化先增多后減少，最后保持穩定：(9)泡菜制作過程中，各階段使壇內形成無氧環境，會使好氧菌生命活動逐漸被抑制②發酵中期(風味最佳):乳酸菌活躍使乳酸不斷積累，pH下降，會使不耐酸菌被抑制③泡菜壇的發酵液表面會長出一層白膜，這層白膜是酵母菌繁殖形成的。(11)泡菜制作過程中影響亞硝酸鹽含量的因素：發酵溫度、發酵時間、食鹽用含有純度較高的乳酸菌，加入“陳泡菜水”相當于接種乳酸菌。4.酒精發酵微生物一酵母菌①代謝特點：是一類單細胞真菌(真核),代謝類型為異養兼性厭氧型，在無氧的條件下能進行酒精發酵。②重要影響因素：溫度是影響酵母菌生長的重要因素，釀酒酵母的最適生長溫度約為28℃;③發酵原理(反應簡式)④生產應用：可用于釀酒、制作饅頭和面包等⑤分布在一些含糖量較高的水果、蔬菜的表面制作果酒：(1)參與發酵的主要微生物及來源：新鮮水果的果皮表面附著的野生酵母菌(2)發酵原理：①許多新鮮水果的果皮表面附著有大量的不同種類的野生酵母菌；②在這些酵母菌的作用下，水果可以發酵成果酒；(通過有氧呼吸大量繁殖，通過無氧呼吸進行酒精發酵產酒精)③相關反應式(同上)(3)發酵條件：①溫度：將溫度控制在18-30℃進行發酵；②氧氣含量：a.氧氣充足的情況下，大量繁殖；b.無氧條件下，進行酒精發酵；(4)步驟：器具消毒→沖洗葡萄→榨汁裝瓶→酒精發酵→果酒檢測(5)實驗分析：①用體積分數為70%的酒精給發酵瓶、榨汁機消毒②沖洗止果皮表面的野生菌種數量減少④去梗之前沖洗；避免葡萄破損，減少被雜菌污染的機會⑤葡萄汁裝入發酵瓶時，要留約1/3的空間菌進行有氧呼吸，快速繁殖，耗盡02后，再進行酒精發酵；b.防止發酵過程中產生的CO2造成發酵液溢出⑥每隔12h左右將瓶蓋擰松一點的目的：排出氣體(CO2),不能全部打開：防止雜菌污染⑧果酒制作過程中，在不滅菌的情況下，酵母菌是如何成為優勢菌種：發酵后期在缺氧和酸性發酵液中，絕大多數微生物的生命活動受到抑制，而酵母菌可以適應這一環境長?它們會對果酒發酵產生影響嗎?如果有，如何避免這種影響?還有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能將糖分解為甘油、酒石酸等，從而使果酒變質，而在有氧的情況下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇轉化為乙醛進而轉化為醋酸。可以通過調節發酵的溫度、pH等來控制乳酸菌含量；可以通過減少02含量、調節發酵溫度、pH來控制醋酸菌含量；⑩如何檢測果酒的發酵情況(檢測是否產生酒精)?聞、品嘗、用酸性條件下的重鉻酸鉀溶液檢測(橙色→灰綠色)5.醋酸發酵微生物—醋酸菌①代謝特點好氧細菌(原核),代謝類型是異養需氧型；當02、糖源都充足時，能將糖分解為醋酸；當缺少糖源(02充足)時則將乙醇轉化為乙醛，再將乙醛變為醋酸；多數醋酸菌的最適生長溫度為30-35℃;②發酵原理(反應簡式)③生產應用：醋酸菌可用于制作各種風味的醋②當糖源、氧氣充足時，醋酸菌還可以直接將糖分解為醋酸；當缺少糖源 (02充足)時則將乙醇轉化為乙醛，再將乙醛變為醋酸；③相關反應式(同上)(3)發酵條件：①溫度——發酵溫度為30-35℃②氧氣供應充足(4)步驟：果酒制作→打開瓶蓋，蓋上紗布→果醋檢測(5)實驗分析；①在制作果醋的過程中，酵母菌是否還會繼續發酵?隨著醋酸發酵的進行，發酵液的pH、發酵溫度等均不利于酵母菌的生長繁殖，因此酵母菌活性很低，不會繼續發酵②醋酸菌從何而來?打開瓶蓋后，空氣中的醋酸菌會進入果酒發酵液中大量繁殖，其他的菌因不適應環境條件(不能利用乙醇)而不能繁殖③采用什么措施可以加快 或者買一瓶醋，將其打開暴露于空氣中，一段時間后在醋的表面會有一層薄膜(即醋酸菌膜),用這層薄膜進行接種亦可；④在制作果酒和果醋的過程中，發酵液分別有哪些變化?引起變化的原因是什么?a.在葡萄酒的制作過程中，發酵液會產生氣泡，這是因為酵母菌發酵產生了CO2;b.發酵過程產熱，會使發酵液溫度上升，應注意控溫；c.發酵過程中，由果皮進入發酵液的花青素會越來越多，因而發酵液的顏色會逐漸加深變成深紅色；d.果醋發酵完成后，發酵液的液面上會出現一層菌膜，即醋酸菌膜；⑤在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止發酵液被污染?a.發酵瓶、榨汁機等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分數為70%的酒精消毒，晾干備用；b.處理葡萄時應先沖洗再去除枝梗；c.排氣時只需擰松瓶蓋，不要打開瓶蓋⑥如何檢測果醋的發酵情況?聞、品嘗、使用pH試紙檢測檢測和比較發酵前后的pH值、觀察醋酸菌膜是否形成。1.研究和應用微生物的前提(即發酵工程的重要基礎):防止雜菌污染， 獲得純凈的微生物培養物，在實驗室培養微生物的要求：①為微生物提供合適的營養和環境條件(培養基)②要確保其他微生物無法混入，并將需要的微生物分離出來(無菌技術);培養基概念：人們按照微生物對營養物分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物；培養基分類(按照物理性質分類):①液體培養基：不含凝固劑(如瓊脂),呈液體狀態，用途：擴大培養獲得大量菌種、常用于工業生產②固體培養基：含凝固劑(如瓊脂),呈固體狀態，用途：分離、計數、鑒定、菌種保藏等；實驗室中最常用的培養基之一：瓊脂固體培養基；微生物在瓊脂固體培養基的表面或內部生長，可以形成菌落；培養基的基本成分：一般都含有水、碳源、氮源、無HCO3-等，有機碳源，如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等③適用范圍(一般情況下),添加無機碳源培養基用來培養自養微生物，添加有機碳源培養基用用范圍(一般情況下),不添加氮源培養基可用來培養固氮微生物。為什么培養基需要氮源?培養基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質源。無機氮源能給自養型微生物提供能源嗎?可以，例如NH3既作為硝化細菌的氮源，也作為能源(NH3氧化釋放的化學能);無機鹽除了可以調節酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，還能有什么功能?有些無機鹽離子可以作為化能合成菌的能源，有些無機鹽離子可以激活某些酶(如Mg2+激活DNA聚合酶)。在提供主要營養物質的基礎上，培養基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及02的需求；是否所有培養基中都必須添加碳源、氮源?不是，例如分離固氮菌不需要額外添加氮源，其可以直接利用空氣中的氮氣。避免雜菌的污染展開，無菌技術主要包括消毒和滅菌。無菌技術工作兩個方面*①對操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；②對用于微生物培養的器皿、接種工具和培養基等進行滅菌；做好消毒滅菌工作后，要注意：避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸，為避免周圍環境中微生物的污染，應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行；無菌技術除用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還能有效避免操作者被微生物感染。消毒：①概念：是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部一部分微生物②方法：a.日常生活中經常用到煮沸消毒法；b.對于一些不耐高溫的液體如牛奶，可使用巴氏消毒法；還可室、接種箱或超凈工作臺在使用前，可以用紫外線照射；滅菌：①概念；是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子②方法：a.培養基一般用濕熱滅菌法，其中高壓蒸汽滅菌的效果最好，培養基的滅菌方法高壓蒸汽滅菌(濕熱滅菌法);b.耐高溫的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿、金屬用具等，可以用干熱滅菌法，培養皿的滅菌方法干熱滅菌(也可用濕熱滅菌法);c.接種過程中，微生物的接種工具、試管口、瓶口通過灼燒滅菌法來滅菌；使用高壓蒸汽滅菌鍋時，不能直接密封升溫，一定要將鍋內冷空氣徹底排出，才能密封升溫，否則，可能引起鍋內壓力達到設定值而溫度不能達到要求。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌完畢后，外溢，甚至導致容器爆裂(須待滅菌鍋內壓力降至與大氣壓相等后才可打開排氣閥開蓋)。酒精消毒的最適范圍是體積分數為70%的酒精，原因：酒精濃度過高時，菌體表面蛋白質變性過快，從而凝固形成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中，酒精濃度過低時，殺菌能力減弱。用紫外線進行消毒時，可以在照射前，適當噴灑酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液來加強消毒效果。高壓蒸汽滅菌使用的儀器為高壓蒸汽滅菌鍋，以水蒸氣為介質，滅菌條件為壓力200kPa、溫度121℃、時間15-30min;干熱滅菌法使用的儀器為干熱滅菌箱，以熱空氣為介質，滅菌條件為溫度160-170℃、時間2-3h;灼燒滅菌是將需滅菌的用具直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，優點是可以迅速徹底地滅菌；3.微生物的純培養培養物；在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體；純培養物：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體；單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物；純培養：獲得純培養物的過程，微生物純培養的步驟包括配制培養基、滅菌、接種、分離、培養；菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的有子細胞群體；一個單菌落相當于一個種群；菌落通常可以用來作為鑒定菌種的重要依據，獲得單菌落的方法：平板劃線法或稀釋涂布平板法。倒平板時使培養基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板，原因是：瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時，若低于50℃不及時操作，瓊脂會凝固；在酒精燈火焰旁進行的原因是：避免雜菌污染；拔掉瓶塞后要使錐形瓶的瓶口通過火焰，以防止瓶口的微生物污染培養基。在倒平板的過程中，若不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板不能用來培養微生物，因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。倒平板時，用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，以防止雜菌污染培養基，剛倒完平板不能直接倒置嗎，應等培養基冷卻凝固，平板冷凝后，要將平板倒置，防止皿蓋上冷凝的水珠落入培養基，造成污染(避免培養基水分過快蒸發);確定所倒平板未被雜菌(主要是細菌)污染的方法：將未接種的空白培養基放入37℃的恒溫箱中培養12h～24h,觀察是否有菌落存在；.劃線工具：接種環；連續劃線的目的：將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面，經過數次劃線后培養可以分離得到單菌落;平板劃線法過程中，接種環蘸了1次菌液；若分五個區劃線，則接種環共需灼燒6次；灼燒后的接種環不可以直接劃線，應待接種環冷卻后再劃線，避免溫度過高殺死菌種；從第二次劃線開始，都應從上一次劃線的末端開始往下一區域劃線，劃線注意事項：①不要將最后一區的劃線與第一區相連②每次劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環進行灼燒滅菌④最后一次劃線結束也應該進行灼燒滅菌，整個操作中灼燒接種環的不同目的：灼燒時期取菌種前殺死接種環上原有微生物，避免接種環上可能存在的微生物污染菌種每次劃線前殺死上次劃線結束后接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時接種環上的菌種直接來源于上一次劃線的末端接種結束后及時殺死接種環上殘留的菌種，避免菌種污劃線時要注意不能劃破培養基原因：①一旦劃破，會造成劃線不均勻， 難以達到分離單菌落的目的；②存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落；培養酵母菌：完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板(一般做三組，目的：平行重復實驗)和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右(培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異)的恒溫培養箱中培養24-48h;注意：①在實驗室中，切不可飲食，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染②使用后的培養基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環境微生物的選擇培養和計數1.從環境中獲得某種特定種類的微生物的思路：根據微生物對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找(1)在被石油污染的土壤中可以篩選石油分解微生物(2)在冰川凍土層可以篩選耐寒微生物；實驗室篩選微生物原理；人為提供有利于目的菌生長的條件(包括營養、溫度和pH等),同時抑制或阻止其他微生物的生長；選擇培養基概念；在微生物學中，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，選擇培養基實例：分離酵母菌、霉菌等真菌，防止細菌生長，使用加入青霉素的培養基，分離固氮菌，使用不加氮源(以N2為氮源)的培養基，分離自養型微生物，使用不加有機碳源(以CO2為碳源)的培養基，篩選分解尿素的細菌：培養基以尿素作為唯一氮源，原因：只有能合成脲酶的細菌才能生長發育繁殖；證明一個選擇培養基具有選擇性：應該設置基礎培養基(如牛肉膏蛋白胨培養基)或完全培養基作為對照，若基礎培養基或完全培養基中生長的菌落數菌多于該選擇培養基，則該選擇培養基具有選擇性；.微生物的選擇培養方法：稀釋涂布平板法；稀釋涂布平板法基礎操作：梯度稀釋和涂布平板，稀釋涂布平板法的作用：分離純化微生物、統計樣品中活菌的數目，涂布時使用的器具為涂布器，應注意涂布均勻，涂布前，涂布器一般浸在酒精中，取出后應放在火焰灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布，待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入恒溫培養箱中培養1-2d,在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離2.微生物的數量測定方法：間接計數法——稀釋涂布平板法、直接計數法——顯微鏡直接計數法；稀釋涂布平板法計數原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌；通過計數平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌；稀釋涂布平板法的計數原則：(1)選擇菌落數為30-300的平板計數；同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值；稀釋涂布平板法結果分析：(1)統計的菌落數往往比活菌的實際數目少；(2)統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示；稀釋涂布平板法統計的是活菌的數量，統計的菌落往往比活菌的實際數目少，原因是：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落30.每g樣品中的細菌數=(C÷V)×M,C代表某一稀釋度下平板上生長菌落數的平均值；V代表涂布平板時吸取的稀釋液體積數值(mL);M代表稀釋倍數；例：將1ml水樣稀釋100倍，在三個平板上用涂布法分別接入0.1ml稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為39、38和37,據此可得出每升水樣中的活菌數為(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000;恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。顯微鏡直接計數法原理；利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量，顯微直接計數法使用的計數工具；血細胞計數板(常用對相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等計數);細菌計數板(可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數);顯微直接計數法優點：快速直觀；顯微直接計數法缺點：(1)統計結果一般是活菌數和死菌數的總和(2)個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。3.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌，實驗步驟：土壤取樣→制備培養基→樣品的稀釋與涂布平板→微生物的培養與觀察，土壤取樣①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤，原因：細菌適宜在該環境中生長②取樣過程：取樣時一般要鏟去表層土，原因：細菌絕大部分分布在距地表3-8cm的土壤層③注意事項：取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌；制備培養基：①作對照：牛肉膏蛋白胨培養基，作用：判斷選擇培養基是否具有選擇作用②實驗組：以尿素為唯一氮源的選擇培養基；樣品的稀釋與涂布平板：①每個濃度至少設置4個平板1.2.3平板是實驗組，4是對照組，為牛肉膏蛋白胨培養基，②整個實驗還需要設置不涂布稀釋液的選擇培養基，目的是：用來判斷培養基中是否含有雜菌(培養基滅菌是否合格)③為獲得菌落數在30-300之間適于計數的平板，測細菌時，一般選用104、10?、10?倍稀釋的稀釋液進行平板培養；④若對于稀釋的范圍沒有把握，應選用稀釋范圍更大的稀釋液進行平板培養；⑤本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記；⑥標記時注意標記在皿底，不能標記在皿蓋；微生物的培養與觀察：①培養條件：細菌一般在30-37℃的溫度下培養1-2d;②觀察：每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，原因：防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目；③一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等；在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。1.發酵工程的基本環節發酵工程及其應用其中發酵工程的中心環節是發酵罐內發酵基本環節選育菌種菌種來源：自然界中篩選、誘變育種、基因工程育種(無雜交育種)原因：工業發酵罐體積一般較大，需要接入的菌種總體積大制、滅菌①在菌種確定之后(結合菌種代謝特點)選擇原料制備；②在生產實踐中，培養基配方要經過反復試驗才能確定；產量大大降低；④培養基和發酵設備都必須經過嚴格的滅菌；接種將擴大培養后的菌種投放到發酵罐中發酵罐內發酵②發酵過程中，要隨時監測培養液中微生物數量、產發酵進程③要及時添加必需的營養組分；④要嚴格監測