1、熒光技術韓東洺細胞生物學科2014-11-52015年6月15日1 熒光和熒光素 利用較短波長的光(激發光)照射樣品，使樣品受到高能量激發，產生較長波長的熒光(發射光)，用來觀察和分辨樣品中產生熒光的物質的成分和位置。 2 常見熒光素： （1）異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC) （2）四乙基羅丹明(rhodamine,RB200) （3）四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC) （4）鑭系 （5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE） （6）多甲藻葉綠素蛋白（peridinin

2、chlorophyllprotein， PerCP） （7）碘化丙啶（propidiumiodide，PI）3 合適熒光素的選擇：具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。熒光效率高，標記后下降不明顯。熒光色澤與背景色澤對比鮮明。標記后能保持生物學活性和免疫活性。標記方法簡單、快速。安全無毒4 熒光顯微鏡（fluorescence microscope） 熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源 、激發濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。光源濾光片光路聚光器鏡頭圖像采集系統 透射光：照明光線從標本下經聚光器透過標本進入物鏡。 落射光：照明光線從標本上經垂直照明器落射到

3、標本，經標本反 射進入物鏡。 透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)光路5 熒光顯微鏡標本制作要求（一）載玻片 載玻片厚度應在0.81.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片 蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。 （三）標本 組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物

4、鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑 封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油 一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間， 保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始 就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后 才能點燃。

5、一天中應避免數次點燃光源。（6）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標 本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時間防止封 裱劑蒸發。（7）熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”無或可見微 弱熒光。“+”僅能見明確可見的熒光。“+”可見有明 亮的熒光。“+”可見耀眼的熒光。熒光分光光度計工作原理： 由光源氙狐燈發出的光通過切光器使其變成斷續之光以及激發光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質的激發光，被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發生的光電流經過放大器放大輸至記錄儀，激發光單色器和熒光單色器的光柵均由電動

6、機帶動的凸輪所控制，當測繪熒光發射光譜時，將激發光單色器的光柵，固定在最適當的激發光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉動，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發射光譜（emission spectrum），簡稱熒光光譜。 7 熒光分光光度計熒光分光光度計原理圖熒光分光光度計的基本結構是 :光源 單色器或濾光片 樣品池 單色器或濾光片 檢測器 注意事項： （1）注意開機順序。（2）注意關機順序。 （3）為延長儀器使用壽命，掃描速度、負高 壓、狹縫的設置一般不宜選在高檔。 （4）關機后必須半小時（等氙燈溫度降下） 方可重新開機。8 熒光技術的應用（1） 免疫熒光技術 用熒光標記的抗體或抗

7、原與樣品(細胞、組織或分離的物質等)中相應的抗原或抗體結合，以適當檢測熒光的技術對其進行分析的方法。 將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測相應特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(direct immunofluorescent technique)”。 用熒光染料標記的第二、第三抗體等檢測相應抗原抗體復合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(indirect immunofluorescent technique)”。 抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。直接法熒光素標記的特異性抗體直接與

8、相應抗原反應。直接熒光抗體染色法示意圖 間接法特異性抗體與相應抗原反應，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結合。間接熒光抗體染色法示意圖 染色程序分為二步，最終使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發出熒光。抗補體染色法 （2） 作為生物大分子篩選與鑒定的標記物 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP，其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色熒光。 在生物學研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途，包括有： 分子標記 利用綠色熒光的發光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(protein tagging)，即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基

9、因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察。 煙草細胞標記的蛋白質進行細胞內的活體觀察 藥物篩選 熒光探針分布是利用信號傳導中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯，根據熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細胞內可溶且對細胞毒性較小，因而常用作熒光探針 。（4） 無機分析 在無機元素分析中 , 主要是通過待測元素與有機試劑( 或熒光試 劑) 生成配合物或發生熒光猝滅效應來測定元素的含量 。目前 可以通過熒光分析測定 70 多種金屬離子和陰離子 , 如A g 、 A l 、

10、 A s 、 A u 、Be 、Bi 、 Ca 、 Cu 、Ge 、 G a 、Hf 、 Hg 、 I n 、I r 、Li 、M g 、 M n 、N b 、N i 、Os 、Pb 、 Pt 、Ru 、 S b 、S c 、 S i 、 S n 、 S r 、Ta 、T l 、Th 、 T i 、 V 、Y 、W 、 Z n 、Ce 、Dy 、Eu 、 G d 、 La 、 Lu 、S m 、Cd 、Cr ( ) 、 Se 、 T e 、 Re 等 （5）有機物分析 近年來有機物熒光分析研究在我國發展迅速 , 年文獻量不斷增加 。主要應用領域有中西藥和臨 床、食品營養和添加劑等試樣 。激光誘

11、導熒光法診斷惡性腫瘤 ,顯微熒光法研究藥物與細胞的相互作用 , DNA編序及含量的熒光法測定均是目前受到關注的熱點問題 。 環境檢測領域: 熒光分光光度計檢測技術已經成為環境污染監測中污染物定性和定量分析的有效手段。如不同類型不同場地的石油及其產品成份各有不同,其熒光光譜也有著顯著的區別,利用油標可在激發310nm,發射365nm處測量淤泥和海水中油污樣品中總油的含量。還可以對機油、柴油、重油、原油及液壓油進行初步鑒定；空氣塵埃中多環芳烴的檢測。其他如陰離子表面活性劑作為洗滌劑污染的主要成份,葉綠素a、葉綠素b、脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素b作為水環境浮游植物生物量和水體富營養化的重要指標以及多環

12、芳烴等都可用熒光分光光度計測量。 食品和藥物成份分析領域： 曾用熒光法分析食品和藥品中的化合物如：維生素A 、維生素B1、B2（核黃素）、B6、維生素BC(葉酸或蝶酰谷氨酸)、維生素C、維生素D 、維生素E( 生育酚) 、維生素P( 蘆丁) 、維生素F（煙酸）、維生素K ，抗生素藥中的青梅毒、金霉素、四環素、抗霉素、鏈霉素和放線菌素D等，抗瘧疾藥中的奎寧、瘧滌平、撲瘧母星、嘧啶甲胺和利凡諾等，麻醉藥中的大麻醇、嘜啶鹽酸鹽、四氫大麻醇、嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、吐根酚堿、依米丁、麻黃素、馬錢子堿鹽酸鹽、毛果（蕓香）鹽酸鹽、弗勒可丁、二丁卡因、麥角酸二乙胺等，鎮痛藥中撲熱息痛、阿司匹林、消炎痛

13、吲哚美辛等等。OLYMPUS BX53OLYMPUS BX53觀察流程熒光分光光度計賽默飛 LuminaFluorescence Spectrometer產品展覽 Thermo Scientific所提供的高靈敏度的Lumina熒光分光光度計適合絕大多數的精確測量應用。激發和發射均可達到0.5nm的光譜帶寬，從而使您的分析工作可以提升到更高的層次。通過選擇溫度控制、固體樣品測試、偏振等附件，滿足您樣品測試的多樣性要求。Lumina完全符合研究和實驗室常規檢測等的各類應用。高分辨單色器為各種高分辨測定提供0.5nm的窄光譜帶寬150W氙燈可在全波長范圍內提供極穩定的光強高靈敏性檢測器能夠提供更為寬廣的測定范圍，可用于近紅外染 料、葉綠素或苯二甲藍染料化合物分析水平光束設計能夠提供最佳發射強度，從而得到最佳熒光信號大容積樣品倉可輕松容納各種附件，用于溫度控制、多樣品池支 架、快速混合、固體采樣和偏振附件技術規格波長范圍: 190 - 1100 nm光譜帶寬: 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10, 20 nm,可調光源: 150W 氙燈