纖維素酶活性的測定一、目的要求了解纖維素酶的組成特點，學習果蔬組織中粗纖維酶活性測定原理和方法。二、基本原理在纖維素酶（Cellulase）作用下，纖維素可被逐步水解并最終生成β-葡萄糖。纖維素結構復雜，沒有任何一種酶能將它徹底水解。纖維素酶是一種多組分酶（C1-Cx），可分為三種不同組分：（1）C1酶是一水解因子，作用于天然纖纖維素的結晶區（棉花纖維為高度結晶性纖維），使氫鍵破裂，呈無定形可溶態，成為長鏈纖維素分子。（2）Cx酶通常包括：內切葡萄糖苷酶（endo-β-1,4-D-glucanase）。這類酶隨機水解β-1,4-糖苷鍵，將無定形長鏈纖維素分子（羧甲基纖維素鈉為人工合成的一種線形纖維素鈉鹽）截短。外切葡萄糖苷酶（exo-β-1,4-D-glucanase），又稱纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolase，CBH）。這類酶作用于β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子。（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase），這類酶將纖維二糖（水楊苷為葡萄糖苷鍵連接的纖維二糖）水解成葡萄糖分子。在堿性條件下，纖維素酶催化纖維素水解的產物纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原。通過測定纖維素酶催化形成還原糖的量可測定纖維素酶的活性。三、材料、儀器及試劑（一）材料蘋果、梨、香蕉等。（二）儀器及用具恒溫水浴鍋、分光光度計、電子天平、試管、移液管或加液器、具塞刻度試管（25mL）、容量瓶（100、1000mL）、燒杯等。（三）試劑1．50mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液母液A（0.2mol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸餾水稀釋至1000mL。母液B（0.2mol/L醋酸鈉溶液）：稱取16.4g無水醋酸鈉（或稱取27.2g三水合乙酸鈉），用蒸餾水溶解、稀釋至1000mL。取6.8mL母液A和43.2mL母液B混合后，調節pH至6.0，稀釋至200mL。2．提取緩沖液（含1.8mol/LNaCl）稱取10.5gNaCl，用50mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液溶解、稀釋至100mL，搖勻。3．50mmol/L、pH5.0檸檬酸緩沖液母液A（0.1mol/L檸檬酸溶液）：稱取21.01gC6H8O7·H2O，溶解、稀釋至1000mL。母液B（0.1mol/L檸檬酸鈉溶液）：稱取29.41gNa3C6H5O7·2H2O，溶解、稀釋至1000mL。取20.5mL母液A和29.5mL母液B混合，調節pH值至5.0，稀釋至100mL。3．3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑參照DNS試劑測定還原糖實驗中的方法配制。4．1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液準確稱取1.00g羧甲基纖維素鈉，用50mmol/L、pH5.0檸檬酸緩沖液加熱溶解后轉移到100mL容量瓶中，待冷卻后，用該緩沖液定容至刻度，4℃保存備用。四、實驗步驟（一）制作葡萄糖標準曲線參照DNS試劑測定還原糖實驗中的方法制作。（二）酶液制備稱取10.0g果蔬樣品，置于經預冷的研缽中，加入20mL經預冷的95%乙醇，在冰浴條件下研磨勻漿后，全部轉入到離心管中，低溫放置10min，然后于4℃、12000×g離心20min。傾去上清液，向沉淀物中再加入10mL經預冷的80%乙醇，振蕩，低溫放置10min，然后在相同條件下離心。再取傾去上清液，向沉淀物中再加入5mL經預冷的提取緩沖液，于4℃放置提取20min，再經過離心后收集上清液即為酶提取液，4℃保存備用。（三）活性測定取兩支刻度試管編號，分別加入1.5mL1%CMC溶液。向一支試管中再加入0.5mL酶提取液，向另一支試管中加入0.5mL經煮沸5min酶提取液作為對照，置于37℃恒溫水浴保溫1小時。取出后迅速加入1.5mL3,5-二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5min。然后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水稀釋至25mL刻度處，混勻。在540nm波長處按照與制作標準曲線相同的方法操作，分別測定各管中溶液的吸光度值。重復三次。五、實驗結果與計算1．將測定的數據填入下列表重復次數樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)540nm吸光度值由標曲查得糖量C(mg)樣品中纖維素酶活性(μg·h-1·g-1FW)樣品對照樣品-對照計算值平均值±標準偏差1232．計算結果根據樣品反應管和對照管溶液吸光度值的差值，在標準曲線上查出相應的還原糖毫克數。纖維素酶活性以每小時每克鮮重（FW）果蔬組織樣品在37°C催化羧甲基纖維素水解形成還原糖的微克數表示，即μg·h-1·g-1FW。計算公式：式中：C——從標準曲線查得的葡萄糖量，mg；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；t——酶促反應時