1、基于CHO細胞單抗生產（第一版） 汪洋/02第1頁07:44提升原料藥出料工序收率2/40CHO細胞構建CHO細胞表示CHO細胞表示后產物純化目錄第2頁07:443/40第一節 CHO細胞構建第3頁生物類似藥開發周期表第4頁引言07:445/40在獲取一種蛋白之前，先要找到該蛋白的基因序列，我們知道了它的名字，就可以到數據庫里進行搜索。有很多免費的數據庫資源，比如NCBI。 找到蛋白，再找到它的DNA序列。 然后針對這段序列設計引物，找到模板或基因組，用PCR的方法擴增出來把擴增出來的基因放到載體上，通過一定的方式如電刺激使得載有可表達目標蛋白的載體進入到細胞內部由于轉入細胞核的質粒有很小的概

2、率（億分之一）整合進宿主的基因組中，所以可以用加壓篩選的手段（主要有抗生素）將這種細胞篩選出來并擴大培養，這樣就得到了可以穩定表達目標蛋白的細胞株工程細胞構建流程概述第5頁細胞株篩選普通流程宿主細胞載體篩選第6頁CHO細胞系宿主普通起源FUT8（ -1,6巖藻糖轉移酶基因），負責將巖藻糖加入抗體N-糖鏈上，形成巖藻糖修飾 （專利日本BioWa制藥，預計2028.07.09）。去除巖藻糖修飾能夠增強百倍以上ADCC作用。2. crispr/cas9原理是 ：crRNA（ CRISPR-derived RNA ）經過堿基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結合形

3、成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配正確序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而經過人工設計這兩種 RNA，能夠改造形成含有引導作用sgRNA （singleguide RNA ），足以引導 Cas9 對 DNA 定點切割。3.鋅指核糖核酸酶（ZFN） 由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶組成。第7頁宿主細胞選擇普通標準第8頁Regulatory-Host cell lineIND提供CHO已知含有顯著致瘤性，普通可不再檢測宿主細胞選擇普通標準第9頁載體普通性組成主要構件：IRES起始位點Promoters開啟子Enhancer增強子

4、Signal peptide信號肽mAb Sequence 單克隆抗體序列Terminator終止子 Resistance markers 抗性標識 Expression promoting element 促穩定表示件第10頁載體普通性組成1、IRES：即內部核糖體進入位點，是一段核酸序列，它存在能夠使蛋白質翻譯起始不依賴于5帽結構，從而使直接從信使RNA（mRNA）中間起始翻譯成為可能。通常來講，真核生物翻譯只能從mRNA5端開始，因為翻譯起始必須依賴于5端帽子結構。2、Promoters：即開啟子，控制基因表示（轉錄）起始時間和表示程度，開啟子本身并不控制基因活動，而是經過與稱為轉錄因子

5、（transcription factor）這種蛋白質（proteins）結合而控制基因活動 抗體序列需使用強開啟子如SV40開啟子等 而抗性基因需要使用減弱開啟子3、Enhancer：即增強子，是指能夠使基因轉錄頻 率顯著增加 DNA序列。增強子主要存在于真核 生物基因組中。 增強子能大大增強開啟子活性。 增強子含有特異性第11頁載體普通性組成 4、Signal peptide：即信號肽（引導新合成蛋白質向分泌通路轉移短肽鏈） 不一樣產物可能需要不一樣信號肽，抗體普通可使用人血白蛋白信號肽，取得較高表示量，且能被完全切除 普通需要進行信號肽預測優化，選擇適當信號肽， 在蛋白質分泌到胞外之前正

6、常情況下會被完全切除 信號肽假說認為，信號肽功效是引導多肽抵達內質網內腔，同時信號肽酶水解，加工完成后分泌到胞外5、mAb Sequence 人源化IgG1恒定區（ CH和CL ）有EM和DL兩個版本，區分是兩個位點氨基酸有突變 Biosimilar: 檢索原研藥專利取得VH和VL序列，并購置原研藥進行序列分析比對，進行序列驗證 Category1ofTherapeuticBiologicalProducts: Hybridoma technique 雜交瘤篩選 Phage display 噬菌體展示第12頁載體普通性組成6、 Terminator ：終止子，是給予RNA聚合酶轉錄終止信號DN

7、A序列。在一個操縱元中最少在構基因群最終一個基因后面有一個終止子。7、 Expression promoting element:即促表示元件 例：UCOE:全稱為泛染色質開放元件（Ubiquitous Chromatin Opening Element），加在外源基因開啟子5端上游，是一個小DNA片段，源于看家基因無甲基化CpG島。研究表明，UCOE能有效預防基因緘默，不論整合到染色質什么位置，目標基因都能連續穩定、高水平地表示。 Merck KGaA 專利，預計.07.20到期 第13頁載體構建普通性標準第14頁構建完細胞篩選非擴增基因擴增基因：在一定程度上表示量隨篩選壓力而增加可選其中一

8、個或選其中任意兩種，使用兩種需要關注HC和LC百分比（LC形成二聚體能夠分泌到胞外）第15頁篩選方法Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening基于熒光激活細胞分選(FACS)技術 篩選方法ClonePix /Cell Xpress TM 克隆篩選及細胞表示系統Limiting dilution 有限稀釋法 第16頁篩選方法Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)-Based Screening The cold capture method used in FACS where

9、 fluorescently labeled antibodies bind to secreted 將待測細胞經熒光染料(FITC、 PE和PerCP等）或熒光標識物特異性染色, 用特定波長激光束照射, 激發熒光。 前向角光散射(forward angle light scatter, FSC)和側向角光散射(side angle light scatter,SSC)分別表征細胞相對大小和內部顆粒度, 相對熒光強度值能反應細胞目標相對表示水平光源第17頁篩選方法ClonePix Semi solid media 第18頁篩選方法Limiting dilution 有限稀釋法(limiting

10、 dilution cloning, LDC)是一個經過梯度稀釋以取得單克隆方法。 它應用范圍廣, 對于大多數細胞類型, 如雜交瘤細胞、 CHO細胞及干細胞等都有很好克隆分離效果。 LDC操作過程大致分為接種(鋪板)、 篩選和擴增。 接種細胞液經過逐層稀釋后加到96孔板中, 每個孔所含細胞個數理論上小于1 第19頁有限稀釋法 Expression VectorHost cellTransfectionMinipoolStable poolSmall-scal BioreactorMonoclonalSubclone一二SubcloneSmall-scal Bioreactor第20頁轉染轉染

11、脂質體轉染法：陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸磷酸根經過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電細胞膜吸附，再經過融合或細胞內吞進入細胞。因為脂質體對細胞有一定毒性，所以轉染后需要更換培養基。如Lipofectamine 3000 Transfection Reagent，普通用于瞬時轉染，因轉染后細胞活率較高，也有部分企業用于穩轉。 電穿孔轉染法：電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。因使用便捷且轉染（入核）效率較高， 大部分企業使用電轉染。電轉染有兩種方案：方形波和指數波，依據實際情況選擇適當波形進行優化，

12、選擇轉染效率和轉染后細胞活率較高電轉條件。CHO細胞選取電轉較多。 病毒感染：對于脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染細胞系提議用病毒感染，此法能夠快速100%感染，檢測成功率高。因操作難度高，使用較少。第21頁克隆篩選一、Minipool 轉染24H后,使用含有壓力培養基，以一定細胞密度接種到96WP,培養14-20天， 挑選出只有單簇細胞生長且匯合度超出30%孔，ELISA檢測表示量，挑選表示 量較高若干個克隆 96WP24WP6WPELISATPPSF125接種F125進行Fed-Batch評定，檢測表示量和質量，選擇產量和質量最優3-5個克隆MonoclonalELISA 、SDS(還

13、原與非還原)表示量檢測還可用：Dot-blot、FortebioELISA第22頁克隆篩選二、 Stable pool 轉染24H后,使用含有壓力培養基，以一定細胞密度接種到T75或F125,加壓 一定時間（依據使用篩選壓力），得到若干個Stable pool，用ELISA（或 FACS ）檢測，選擇表示量（或陽性率和高表示）1-2個Stable pool進行單 克隆化 Stable pool96WP24WPTPPSF125接種F125進行Fed-Batch評定，檢測表示量和質量，選擇產量和質量最優3-5個克隆Monoclonal以1-3個/孔鋪板96孔板進行單克隆化，普通不添加篩選壓力或者使

14、用半壓6WPELISAELISAELISA 、SDS(還原與非還原)第23頁單克隆在細胞克隆中，對培養細胞來說，從原有克隆中，再篩選出含有某種特征細胞進行培養，就是亞克隆。亞克隆目標是取得單克隆CFDA-當前來說只要理論上證實是單克隆FDA- Clonality Limiting dilution ：classic 0.5cell/well 2 roundsCSI/Cell Metric第24頁單克隆拍照系統第25頁FDA當前對于單克隆證實方法意見第26頁克隆性FISH不但可用于已知基因或序列染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標識及染色體畸變研究。在基因定性、定量、整合、表示等方面研究中

15、頗具優勢。第27頁篩選檢定第28頁細胞代次要求第29頁細胞庫相關法規要求第30頁細胞庫相關法規要求1、程序性降溫儀：可編程降溫程序，能夠準確到達設定溫度，重復性。穩定性好，適合于細胞建庫使用2、程序降溫盒：需在降溫盒夾層加入異丙醇，可實現-1/ min，每個凍存盒普通可放16支，比較適合用于試驗室規模標準凍存程序：為降溫速率-1-2/ min；當溫度達-25以下時，可增至-5-10/min；到-100時，則可快速浸入液氮中。也可將裝有細胞凍存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。第31頁細胞庫相關法規要求凍存容器：（供給商:CBS、MVE、 Thermo

16、 Fisher Scientific ）普通液氮罐：直接凍存在液態液氮中，很輕易引發交叉污染氣化液氮罐：液氮存于罐底部，經過底部液氮氣化維持溫度隔氮型液氮罐：液氮貯存于夾層中，與樣品完全隔離，取用安全且將交叉污染可能降到最低第32頁細胞庫相關法規要求第33頁細胞庫檢定第34頁細胞庫檢定-CHO細胞檢測項目MCPWCPEOPC細胞判別+(+)細菌、真菌檢驗+分歧桿菌檢驗+支原體檢驗(+)(+)(+)內、源病毒污染檢驗細胞形態觀察及血吸附試驗+體外不一樣細胞接種培養法+動物和雞胚體內接種法+-+逆轉錄病毒檢驗+-+種屬特異性病毒檢驗（鼠源）(+)-牛源性病毒檢驗(+)(+)(+)豬源性病毒檢驗(+

17、)(+)(+)其它特定病毒檢驗(+)(+)(+)染色體檢驗(+)(+)(+)成瘤性檢驗(+)(+)-致瘤性檢驗(+)(+)-( +) 表示要依據細胞特征、傳代歷史、培養過程等情況要求檢鏈項目。 第35頁細胞庫穩定性考查細胞穩定性研究儲存條件下穩定性傳代/擴增過程穩定性基因水平目標產物表示水平細胞本身穩定性第36頁細胞庫穩定性考查儲存條件下穩定性屬于原液放行檢定項目第37頁細胞庫穩定性考查傳代/擴增過程穩定性第38頁經過細胞構建降低表示雜質案例CHOK1 cell Expression of antibody A Acidic variants: NMT 14.0%Basic variants:

18、 NMT 30.0%USP Acceptance criteriaAcidic variants: NMT 35.0%Basic variants: NMT 15.0% Originaldrugs Acidic variants: NMT 10.0%Basic variants: NMT 10.0%第39頁游離巰基、半胱氨酸殘基N-末端谷氨酰胺環化甲硫氨酸氧化天冬酰胺脫氨基作用和天冬氨酸異構化C-末端賴氨酸不完全截除糖基末端唾液酸化抗體電荷異質性主要成因堿性峰堿性峰堿性峰酸性峰酸性峰酸性峰第40頁重鏈C-末端賴氨酸不完全截除堿性峰羧肽酶是移除C-賴氨酸酶可用弱陽離子層析檢測分析降低賴氨酸變體策

19、略：降低細胞培養溫度延長發酵時間提升鋅離子濃度降低銅離子濃度重鏈和輕鏈 N-末端谷氨酰胺環化可被谷氨酰胺環化酶催化但在抗體儲存過程中，環化作用是自發可用基于電荷分析方法，如 IEF、CEXpH 4 6，pH升高環化降低pH 6 8，pH升高環化增加在中性條件下環化作用最少降低谷氨酰胺環化策略：盡可能選擇中性條件控制溫度（高溫條件可加速環化）甲硫氨酸氧化堿性峰主要位點：M252、M428檢測：先還原成HC+LC，聯苯層析柱 加 UV215nm 加 質譜降低甲硫氨酸氧化策略：防止高溫、紫外線、叔丁基過氧化氫，溶氧不要過高堿性峰焦谷氨酸氨肽酶去環化，釋放自由氨基，可恢復基于Edman降解法N-末端氨

20、基酸測序第41頁糖基末端唾液酸化酸性峰常發生在糖鏈末端半乳糖殘基上可用唾液酸酶去除，用IEF、CEX檢測抗體生產追求NeuAc /NeuGc百分比最大化最大化策略：+丁酸鈉，下調培養溫度NeuAc /NeuGc測定方法：HPLC、MS、IEF 唾液酸酶去除唾液酸前后對比天冬酰胺脫氨基作用酸性峰可自發發生，無需酶催化檢測：人為加速脫氨基 （37C，pH8） 之后用 CEX，HIC降低脫氨基作用策略：盡可能防止熱點序列 Asn-Gly降低培養溫度，適當下調pH游離巰基、半胱氨酸殘基酸性峰抗體二硫鍵可能未配對或配錯對，造成抗體表面電荷分布改變和酸性峰出現用木瓜蛋白酶把完整抗體解離成Fab和Fc后，用

21、RP-HPLC可檢測到游離巰基降低游離巰基、半胱氨酸殘基策略：在培養基中加適量硫酸銅（氧化劑）第42頁有研究發現 ，單克隆抗體 C-末端殘留賴氨酸在靜脈注射至體 內后 ，會被血清中羧肽酶 B 快速降解 ，完整 C-末端賴氨酸半衰期約為 62 min。另有研究發現 ，從血清中獲得抗體通常均缺少C-末端賴氨酸，也從其次證實 了C-末端賴氨酸殘基在體內是受到限制。 K H A W LI等 經過置換色譜法分別制備 出酸堿變體 ，并對其進行評價 ，發現 C-末端賴氨酸變體對抗體 效價 、安全性均無影響。重鏈C-末端賴氨酸盡管 C-末端賴氨酸變體對單克隆抗體 生物學活性無影響 ，但抗體賴氨酸變體程度也反

22、映了生產工藝穩定性和產品一致性 ，尤其在生物類似藥研發過程中和生產工藝改變后 ，更應對產 品賴氨酸變體進行檢測和評價 。 所以 ，在生產工藝研發 中 ，應嚴格監控 C-末端賴氨酸變體 ，并深入了解其與產品質量和安全性關系。 單克隆抗體大規模生產時 ，賴氨酸變體應控制在可行范圍內，并評定是否需作為在產品放行 、穩定性試驗和工藝改變時一項檢測指標。 第43頁第二節 CHO細胞表示第44頁07:4445細胞培養基本要求細胞組成基本元素：碳、氫、氧、氮、鈉、鉀、鈣、鎂、磷，適當培養基是細胞培養必要條件1.氨基酸：是細胞合成蛋白質原料。全部細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、

23、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。另外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有主要作用，所含氮是核酸中嘌令和嘧啶合成起源，一樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要基本物質。 體外培養各種培養基內都含有必需氨基酸。小花絮：經過幾萬年動物進化，自然選擇結果，動物體內全部氨基酸都左旋，所以右旋氨基酸是不能用于細胞培養第45頁07:4446細胞培養基單糖：培養中細胞能夠進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。另外六碳糖也是合成一些氨基酸、脂肪、核酸原料。細胞對葡萄糖吸收能力最高，半乳糖最低。 體外培養動物細胞時，幾乎全部培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含能源物質。 蛋白質一級結構維系鍵是肽鍵，二級結構借氫鍵維系，三級

24、結構維系鍵主要是非共價鍵（次級鍵）：氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵等，也可包括二硫鍵。這些鍵形成主要依靠CHON，所以糖和氨基酸是細胞培養基中最主要組成部分第46頁07:4447細胞培養基維生素：主要飾演輔酶、輔基角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養基常有成份。第47頁07:4448細胞培養基無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩、硫等。 微量元素即使在細胞體內含量非常非常少，卻是蛋白質四級結構中非常主要維系鍵形成關鍵元素，對于藥品而言該四級結構控制著藥代、藥理相關過程

25、第48頁07:4449促生長因子及激素 已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞功效、保持細胞狀態（分化或未分化）含有十分主要作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有顯著促進作用，如氫化可松可促進表皮細胞生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。細胞培養基第49頁07:4450細胞培養基本要求滲透壓 ：細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養人體細胞理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260320mOsm/kg范圍都

26、適宜。 pH 、氣體 也是細胞生存必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參加三羧酸循環，產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成份。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開放培養時，普通置細胞于95空氣加5二氧化碳混合氣體環境中培養。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞所需成份，它主要與維持培養基pH有直接關系。動物細胞大多數需要輕微堿性條件，pH值約在7274在細胞生長過程中，隨細胞數量增多和代謝活動加強，二氧化碳不停被釋放，培養液變酸，PH值發生改變。因為NaHCO3輕易分解為二氧化碳，很不穩定，致使緩沖系統難以準確地控制。故這一緩沖系統適合密閉培養。第5

27、0頁07:4451CHO細胞性質中華倉鼠卵巢細胞（CHO）是治療性重組蛋白工業化生產主要宿主細胞。較于其它細胞類型，CHO細胞是治療性蛋白生產主要宿主細胞原因以下：（1）能在化學成份限定和無血清懸浮培養中穩定生長，（2）在人類致病病毒應答方面表現出合理安全性，（3）能夠表示與人相同翻譯后修飾。另外，CHO細胞表示系統最主要優勢之一是能夠輕易得到基因改造細胞克隆，這些克隆能夠表示產量充分和質量可接收人用目標基因（GOI）蛋白。這些既能夠經過將目標基因特異性位點整合插入到宿主細胞基因組中，也能夠經過二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）系統基因擴增方法將基因隨機整合到宿主細胞基因組中。

28、然而，因為糖基化模式與人類不完全相同，造成CHO細胞產生重組蛋白在一些時候依然表現出免疫源性。第51頁07:4452單抗性質抗體是由B細胞分泌，含有識別外源性病原體并誘發免疫應答一類糖蛋白，人體內有5種類型抗體：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，其中IgG1 在血液中占主導地位第52頁07:4453當前全部獲批重組單抗藥品都是IgG 亞型FabFc鉸鏈區單抗性質第53頁07:4454CHO細胞表示單抗過程細胞核中DNA轉錄成為信使RNA，信使RNA經過核孔進入細胞質，被細胞質中核糖體發覺，進入核糖體進行翻譯，經過原料氨基酸合成為多肽，（cho細胞不能本身無合成脯氨酸基因，需在培養基中加L

29、-脯氨酸），核糖體附著在內質網上，核糖體合成多肽進入內質網，被內質網上附著大量酶加工、剪切，最終內質網分泌囊泡將被加工過多肽包裹運輸到高爾基體，高爾基體進行深入修飾，形成蛋白質。然后高爾基體分泌囊泡包裹蛋白質，將蛋白質運輸到胞外 表示蛋白過程概述第54頁07:4455CHO細胞表示單抗過程第55頁07:4456CHO細胞表示單抗過程真核細胞中染色質分為兩部分，一部分為固縮狀態，如間期細胞著絲粒區、端粒、次溢痕，染色體臂一些節段部分重復序列和巴氏小體均不能表示，通常把該部分稱為異染色質。與異染色質相反是活化常染色質。真核基因活躍轉錄是在常染色質進行。轉錄發生之前，常染色質往往在特定區域被解旋或松

30、弛，形成自由DNA，這種改變可能包含核小體結構消除或改變，DNA本身局部結構改變，如雙螺旋局部去超螺旋或松弛、DNA從右旋變為左旋，這些改變可造成結構基因暴露，RNA聚合酶能夠發生作用，促進了這些轉錄因子與開啟區DNA結合，造成基因轉錄第56頁07:4457真核生物基因轉錄在細胞核內進行，而翻譯則在細胞質中進行。在轉錄過程中真核基因有插入序列，結構基因被分割成不一樣片段，所以轉錄后基因調控是真核生物基因表示調控一個主要方面，首要是RNA加工、成熟。各種基因轉錄產物RNA，不論rRNA、tRNA還是mRNA，必須經過轉錄后加工才能成為有活性分子蛋白質合成翻譯階段基因調控有三個方面： 蛋白質合成起

31、始速率調控； mRNA識別； 激素等外界原因影響。蛋白質合成起始反應中要包括到核糖體、mRNA蛋白質合成起始因子可溶性蛋白及tRNA，這些結構友好統一才能完成蛋白質生物合成。mRNA則起著主要調控功效。CHO細胞表示單抗過程第57頁07:4458CHO細胞表示單抗過程真核生物mRNA“掃描模式”與蛋白質合成起始。真核生物蛋白合成起始時，40S核糖體亞基及相關合成起始因子首先與mRNA模板近5端處結合，然后向3方向移行，發覺AUG起始密碼時，與60S亞基形成80S起始復合物，即真核生物蛋白質合成“掃描模式”。真核生物5末端能夠有3種不一樣帽子：0型、I 型和 II 型。不一樣生物mRAN可有不一

32、樣帽子，其差異在于帽子堿基甲基化程度不一樣。帽子結構與mRNA蛋白質合成速率之間關系親密： 帽子結構是mRNA前體在細胞核內穩定原因，也是mRNA在細胞質內穩定原因，沒有帽子轉錄產物會很快被核酸酶降解； 帽子能夠促進蛋白質生物合成過程中起始復合物形成，所以提升了翻譯強度； 沒有甲基化(m7G)帽子(如GPPPN-)以及用化學或酶學方法脫去帽子mRNA，其翻譯活性顯著下降。第58頁07:4459翻譯后修飾如脫酰胺、二硫鍵形成、末端賴氨酸處理（切除）和糖基化，后者是一個發生在內質網和高爾基體內復雜翻譯后修飾。依據作用機理，生物藥品分子糖型可能決定了其臨床療效，所以糖基化修飾被認為是單抗藥品一個關鍵

33、質量屬性（CQA）CHO細胞表示單抗過程第59頁 CQA：糖基化修飾N-糖位點 (ASN-X-Thr/Ser, X非Pro)O-糖位點 (任意 Thr 和 Ser)60O-糖基化N-糖基化（Enbrel-etanercept）第60頁最主要形式O-糖基化類型常見8種粘蛋白類型O-糖關鍵結構常見粘蛋白類型O-糖質譜分子量61第61頁N-糖基化類型62Hybrid雜合型High mannose高甘露糖型治療性重組抗體常見N-糖基化組成重點關注對Fc功效影響和存在免疫原性糖型Complex復雜型第62頁N-糖形成過程內質網高爾基體各種剪切酶（減去單糖）及轉運酶（加上單糖）作用下對糖基化形式進行編輯6

34、3第63頁N-糖基化對蛋白功效影響促進蛋白溶解度，一定程度預防蛋白聚集保護蛋白免受蛋白酶酶切可能引發免疫原性對ADCC、CDC等生物效應造成影響對體內循環半衰期有一定影響64影響蛋白質構象改變第64頁65N-糖基化對蛋白構象影響鉸鏈區影響分子構象“鉸鏈區”存在為分子提供了柔性，使得Fab-Fc、Fab-Fab間能夠有一定擺動。進而影響IgG空間構象，影響Fc片段活性區域與各種受體結合。N糖基化一樣影響分子構象N糖基化位于Fc片段CH2共有序列 （Asn-X-Ser/Thr）經過晶體X衍射發覺蛋白與糖以對等方式相互作用而影響彼此構象N-Glycosylation siteFcRs(FcRIIa、

35、FcRIIb、FcRIIIa、FcRIIIb)FcRnC1q結合第65頁ADCCAntibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity （抗體依賴性細胞介導細胞毒作用）1、IgG抗體與靶細胞表面抗原決定簇特異性地結合；2、之后NK細胞、巨噬細胞等借助其表面受體與結合在靶細胞上IgG Fc段結合；3、活化NK細胞等釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質殺傷靶細胞；4、靶細胞發生細胞凋亡，抗體被肝處理。66*與去巖藻糖化、唾液酸百分比等相關第66頁CDCComplement Dependent Cytotoxicity （補體依賴性細胞毒作用）補體參加細胞毒作用，即經過

36、特異性抗體與細胞膜表面對應抗原結合，形成復合物而激活補體經典路徑，所形成攻膜復合物對靶細胞發揮裂解效應67*與末端半乳糖化百分比相關第67頁甘露糖受體功效甘露糖受體，屬于哺乳動物類C型凝集素超家族組員,主要表示于巨噬細胞和未成熟樹突狀細胞表面, 可與末端甘露糖特異結合。高甘露糖型抗體因為可被巨噬細胞甘露糖受體結合并發生吞噬作用，所以在體內循環時間降低，半衰期減短，所以應盡可能降低抗體中高甘露糖糖型百分比。68*與高甘露糖型百分比相關第68頁舉例Additional Terminal ResidueEffect on receptor bindingEffect on ADCCEffect on

37、 C1q bindingEffect on CDCEffect on Half-life in Serum巖藻糖減弱減弱無影響無影響無影響唾液酸減弱減弱無影響無影響增強半乳糖無影響無影響增強增強無影響高甘露糖增強增強減弱減弱減弱N-乙酰葡糖胺增強增強減弱減弱未知末端寡糖反抗體活性影響Current Opinion in Immunology , 20:471478第69頁07:4470細胞培養條件對于糖型影響補料成份抗體糖型取決于培養基中各營養物質濃度，營養物質中糖分子作為糖基化所需糖-核苷酸前體存在培養基中。培養基中葡萄糖水平改變顯著影響聚糖異質性，在流加模式中更為主要，產品糖型一致性是取得

38、臨床預期結果保障。已發覺，伴隨葡萄糖濃度提升，CHO細胞及新近構建細胞系（如F2N78）所表示抗體半乳糖和唾液酸糖基化水平會提升葡萄糖適當操作區間濃度（2-8g/L）。葡萄糖饑餓程度在培養早期對細胞影響最大第70頁07:4471細胞培養條件對于糖型影響二價陽離子如Mn2+（4-40M）能夠發覺產物半乳糖苷化和唾液酸化提升。因為Mn2+是高爾基體中-1,4-半乳糖苷轉移酶輔助因子。二價陽離子在分泌路徑將寡糖連接至目標物中發揮作用，沒有它們N型連接寡糖鏈過程將會受到抑制。補料成份第71頁07:4472細胞培養條件對于糖型影響丁酸鈉能夠經過將細胞周期滯留而增加特定mAb產率，然后，在培養基中加入丁酸

39、鈉觀察到會降低半乳糖修飾水平并增加mAb堿性電荷異構體。添加丁酸鈉也觀察到會降低mAb唾液酸修飾水平補料成份第72頁07:4473細胞培養條件對于糖型影響單糖連接至正在成長天線寡糖鏈結構中需要核苷酸糖作為供給者，其效率對最終糖型影響極深。尿苷被認為是合成糖-核苷酸結合體主要前體之一，所以影響產品質量。補料成份第73頁07:4474細胞培養條件對于糖型影響培養基中補充氨基酸對唾液酸修飾影響已被很好地證實。氨基酸消耗直接與表示抗體所序列所含氨基酸種類相關。所以為了取得最正確產品質量，在培養過程中補充關鍵氨基酸并進行濃度分析是勢在必行。這些還引導出了新詞匯如“fermentanomics”出現，利用

40、1D1HNMR技術實時或近似實時監控補料成份與細胞代謝。利用多重變量數據分析評定mAb糖基化與過程變量及諸如氨基酸等原材料關系，從而對復雜糖基化過程產生更為深入了解。補料成份第74頁07:4475細胞培養條件對于糖型影響對細胞最優培養溫度可能不一定是細胞表示產物最優溫度。低些培養溫度（從37降至30-35）發覺能夠使細胞滯留在G0/G1期，含有更高細胞活力和更少細胞凋亡。在低溫度下發覺細胞內UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc數量降低。研究者證實mRNA水平提升（而非生長周期滯留）是低溫下取得高產率背后原因。最近，經過關鍵糖分支酶研究對低溫條件下mAb產品有了更加好了解。發覺這些酶下調造

41、成終產品糖鏈結構異常。細胞活力和溫度第75頁07:4476細胞培養條件對于糖型影響溶氧影響全部代謝過程都需要氧氣，所以溶氧控制對優化細胞生長很主要。細胞表示糖蛋白/抗體糖型隨溶氧（DO）水平改變而改變。在鼠CC9CC10細胞表示IgGmAb1時發覺半乳糖基化水平差異，低溶氧條件下半乳糖糖基化水平也低。這個似乎是因UDP-Gal低水平所致，因為葡萄糖分解路徑造成半乳糖利用率下降。另外一個解釋是早期形成重鏈間二硫鍵對要加入正在生長寡糖鏈半乳糖產生了空間位阻。不一樣型號生物反應器，即使到達相同過程控制和溶氧條件，依然會對糖型有影響。利用雜交瘤細胞系（BCF2）進行一室縮小規模模擬溶氧張力（DOT）波

42、動培養，碩士物培養環境差異對mAb糖型影響。據報道，10%DO水平下培養三天線結構和唾液酸數量會增加。DOT對鼠雜交瘤細胞系HFN7.1生產IgG1糖型影響極深，DOT在10%-90%空氣飽和度改變時，半乳糖和唾液酸最大改變量分別達20%和30%。短暫DOT改變對終產品質量有著顯著影響。第76頁07:4477細胞培養條件對于糖型影響氨和PH值氨是CHO細胞代謝谷氨酰胺或天冬酰胺時釋放到培養基中有毒副產物。據知，氨水平增加會改變CHO細胞表示IgG糖型，因為銨根離子會升高高爾基體pH值并抑制與寡糖鏈相關酶酶活。對mAb生產而言，理想胞內氨濃度低于2mM，胞外濃度4-10mM。高爾基體pH微小上升

43、會造成-2,3-唾液酸轉移酶定位錯誤，維持pH近中性會改變高爾基體形態。高pH會影響UMP電離狀態，UMP是一個UDP-GlcAc轉運子逆向轉運物質，從而影響UDP-GlcNAc轉運進高爾基體。氨水平增加一樣顯示出：高爾基體高pH時，引發半乳糖和唾液酸修飾降低，從而引發甘露糖修飾增加。氨也經過賠償胞內核苷酸糖庫平衡而影響抗體糖型（圖 3）。已經有推論因為CMP-SiaT酶水平降低，氨水平提升阻止了唾液酸從胞質轉運到高爾基體。更深入，從可用文件獲知pH（理想pH6.8-7.8）對糖型顯著影響與不一樣表示細胞系相關，另有結果表明pH在不一樣細胞系中對糖型微觀異質性有影響。還有些研究者報道稱人細胞系

44、中高pH會引發半乳糖修飾水平下降，另外一些人發覺雜交瘤細胞系中高pH引發IgG3半乳糖修飾水平增加。第77頁07:4478滲透壓細胞培養條件對于糖型影響滲透壓是另外一個影響mAb生產、細胞生長和細胞活力關鍵過程參數。一定范圍高滲（300-400mOsm/kg）有益，并被用來提升重組蛋白在CHO細胞中表示。添加堿、葡萄糖或其它補料會提升滲透壓，從而影響產品質量和特殊mAb產品。長時間培養和培養基高滲透壓會產生高甘露糖型抗體藥品。第78頁07:44提升原料藥出料工序收率79原因正向影響負面影響錳離子在Mn2+濃度高時，IgGN-聚糖修飾含有高甘露糖型；IgG Man5糖型降低在有尿苷和半乳糖補充下

45、，半乳糖修飾水平高。葡萄糖高濃度葡萄糖與可產生前體相關，造成高水平半乳糖修飾和唾液酸修飾耗盡時，降低IgG位點占據；限制葡萄糖水平造成低水平糖基化。丁酸鈉丁酸鈉存在時，唾液酸水平微小下降；降低半乳糖修飾。氨/谷氨酰胺伴隨氨水平增加，抑制半乳糖和唾液酸修飾。氨基酸伴隨色氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸補充唾液酸修飾水平增加。培養基中高濃度天冬酰胺造成低半乳糖型修飾。血清無血清培養中糖型異質性低；無血清培養基中唾液酸修飾高&半乳糖類修飾低。細胞培養條件對于糖型影響小結第79頁07:44提升原料藥出料工序收率80原因正向影響負面影響氧DO水平波動會增加三天線型和唾液酸修飾。在低DO水平下IgG半乳糖修飾降低

46、；在低DO水平下半乳糖修飾降低而唾液酸修飾增加。pH低pH時，葡萄糖修飾&唾液酸修飾水平提升。伴隨pH上升，末端半乳糖修飾降低&巖藻糖修飾增加；高pH時，半乳糖修飾水平下降。溫度低溫時，因為基因表示下調，造成mAb糖鏈結構成熟度下降。滲透壓高滲時，增加Man5修飾水平。在高滲（420mOsm/Kg）時對糖型無顯著影響；在較高滲透壓時會降低巖藻糖修飾水平（在285mOsm/Kg時70%，345mOsm/Kg時40%）。細胞系因為二等分GlcNAc加入使得ADCC活性增加。在CHO細胞中缺乏對應糖基轉運酶，缺失a-2,6-唾液酸；NS0細胞系增加a-1,3-半乳糖表位。細胞培養條件對于糖型影響小結

47、第80頁07:4481細胞培養條件研究DOE普通在藥品進入臨床II期研究，產品開始進行商業規模生產時候，過程定性研究就要開啟。這部分工作最少需要1215個月。完成過程定性研究工作后，才能開展工藝放大，技術轉移和工藝驗證等后續工作。過程定性（process characterization）是對生物制藥生產過程進行系統研究，意在建立含有較強穩健性（robust），柔順性（compliance）生產工藝，滿足大規模工業生產對工藝開發要求。這部分工作包含，對大規模生產過程進行預先風險評定，研究過程操作參數對性能指標影響, 區分關鍵參數與非關鍵參數，確定操作參數控制范圍,了解各操作參數之間交互作用等。

48、進行過程定性研究，假如在實際生產規模上進行試驗，不但成本昂貴，而且不具操作性。當前主要采取“規模縮小模型”（sale down model），在試驗室內利用小型化生物反應器完成過程定性研究。第81頁07:4482細胞培養條件研究DOE在試驗室里利用“規模縮小模型”完成商業規模生產過程定性研究，需要遵照嚴謹科學程序。首先，要對以往批次數據進行充分挖掘、分析，在此基礎上，完成生產過程風險評定，依據各操作參數對過程性能指標影響程度，對其進行優先級別排序。建立能夠充分模擬大規模生產過程“規模縮小模型”第82頁07:4483細胞培養條件研究DOE在進行過程定性研究之前，首先需要對以往批次數據進行充分挖掘

49、分析。在此基礎上，對生產過程不一樣步驟（培養基、種子鏈及生產期）進行風險評定，這其中包含：潛在風險發生嚴重程度，風險發生幾率，風險是否含有可檢測性等。通常使用危害分析與關鍵點控制(HACCP) 、失敗模式和影響分析（Failure mode and effects analysis）、因果圖（cause-and-effect diagrams）等工具對以上過程要素進行風險評定。這其中FMEA是利用數字（1到10）對過程風險進行量化分級。MPN是綜合評價風險嚴重程度，發生幾率，以及風險是否含有可檢測性進行綜合評判。第83頁07:4484細胞培養條件研究DOE第84頁07:4485進行過程定性研究

50、，首先需要建立一個能夠充分反應商業規模生產過程特點“規模縮小模型”。該模型能夠在參數評價，工藝開發中，起到模擬商業規模生產效果。當然，建立好一個“規模縮小模型”后，需要對其“等效性”進行驗證。開展此工作流程，首先確定需要進行規模縮小操作參數，找出其中關鍵參數，確定參數能夠接收改變范圍。進行規模縮小模型試驗，判定該模型是否與其代表大規模培養工藝含有等效性。細胞培養條件研究DOE第85頁07:4486細胞培養條件研究DOE細胞培養所包括到參數在進行規模縮小時，依據其縮小策略不一樣，通常能夠分為兩類。一類與體積親密相關，如工作體積、流加體積，攪拌和通氣。一類是獨立于體積參數，如pH、溶氧和溫度。對過

51、程參數進行規模進行體積縮小時，非體積依賴型參數保持不變，體積依賴型參數則按照培養體積縮小百分比，進行線性遞減。但在實際工作中，受反應器幾何尺寸，液體表面體積比，以及操作可控能力等原因影響，一些體積依賴參數如反應器攪拌速率、通氣流量又不能簡單了解為線性遞減第86頁07:4487體積非依賴型參數過程溫度pH 接種體積(v/v) for each step 流加策略氧氣傳遞速率二氧化碳去除速率消泡策略細胞培養條件研究DOE第87頁07:4488體積依賴型參數培養基滅菌前后體積改變流加速率空氣流量氧氣流量細胞培養條件研究DOE第88頁07:4489細胞培養條件研究DOE舉例：2L Applikon 生

52、化反應器模擬2,000L發酵罐時，各操作參數進行規模縮小時所采取策略。 第89頁07:4490完成操作參數規模縮小，建立了整個培養過程“規模縮小模型”后，就需要對此模型進行驗證，以判定該模型與其所代表商業培養規模是否含有等效性。驗證方法是比較兩過程性能參數是否一致。據此來判定，建立“規模縮小模型”是否成功。細胞培養過程性能指標常被用來當做判定依據。細胞培養條件研究DOE第90頁07:4491細胞培養條件研究DOE細胞生長情況能夠經過比較生長曲線，或者直接比較細胞比生長速率，來考查不一樣培養規模下細胞生長情況。這部分工作也能夠經過測定培養液光密度、固形物體積，細胞干重、細胞濕重等方法進行。模擬效果好“規模縮小模型”能夠與大規模培養過程含有相同細胞比生長速率和細胞