1、高效液相色譜法測定水體中的苯酚和萘酚一、實驗目的1、了解色譜法的分離原理，初步學會使用高效液相色譜儀；2、利用高效液相色譜儀分離測定水體中的苯酚及a-荼酚。二、實驗原理1、色譜法的分離原理溶于流動相中的各待測組分經過色譜柱固定相時，由于各組分與固定相發生 作用（吸附、分配、離子吸收、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯 留時間不同，從而先后從固定相中流出，達到分離的目的，又稱色層法、層析法。2、高效液相色譜儀使用原理高效液相色譜儀由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等 幾部分組成四個系統即高壓輸液系統、進樣系統、分離系統和檢測系統。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣

2、器進入流動相， 被流動相載入色譜柱（固定相）內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不 同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱 內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以 圖譜形式打印出來。正是根據物質的定性與定量關系，不同的物質順序離開色譜柱，通過 檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含 有的物質。3、苯酚及a-荼酚的分離原理及標準溶液準備對于一些組分比較簡單的已知范圍的混合物，或無已知物的情況下，可以利 用保留值定性。保留值的大小取決于分配系數之比，即與

3、組分的性質、固定液的 性質及柱溫有關，與固定液的用量、柱長、流速及填充情況無關。在一定操作條 件下，用對照品配成不同濃度的對照液，定量進樣，用峰面積或峰高對對照品的 量（或濃度）做校正曲線，求回歸方程，然后在相同條件下分析試樣，計算含量， 這種方法稱為校正曲線法。通常截距近似為零，若截距較大，說明存在一定的系 統誤差。本實驗，苯酚的波長為270nm，a-荼酚的波長為295nm。使得兩種物質 的吸收峰達最大值，最終選定在254nm條件下。分別配置單樣和混合液濃度為 100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L 標準溶液，分別進樣，記錄保留 時間和出峰面積，用于定性分析

4、。繪制標準曲線，用于定量分析，計算出樣品濃 度。三、實驗儀器和藥品高效液相色譜儀；流動相過濾器；超聲波清洗器；分析天平；100 mL容量瓶3個、250 mL容量瓶、200 mL量筒、滴管、100應-1000應 移液槍、20由-200應移液槍；苯酚、a-萘酚、乙腈、蒸餾水。四、實驗步驟1、開機前準備工作查資料，確定流動相的比例，一般選用甲醇、水、乙腈按比例配制之后根據 需要選擇不同的濾膜，對流動相進行抽濾除雜質；再進行超聲脫氣泡1020min； 配制樣品和標準溶液，必要時也用0.45pm濾膜過濾。2、開機（1）開啟計算機，運行Bootp Serve程序。（2）依次開啟儀器各模塊電源。（3） 待各

5、模塊自檢完成后，設定參數。菜單欄單擊control-monitor instrument，單擊Pump圖標，出現參數設定菜單，設定Flow 1.0 mL/min，單擊 Pump off變為Pump on；單擊Light圖標后，單擊Light off變為Light on；關閉 菜單欄。3、在線檢測（1）在工作界面，選擇通道，填寫實驗信息，在方法菜單欄上點擊采樣控 制，設置采樣時間、文件保存路徑、保存方式、文件名。（2）在方法菜單欄點擊積分，選擇積分參量、積分方法、樣品重量、積分 最小面積，時間參數等相關參數后點擊“采用”按鈕。（3）在方法菜單欄點擊譜圖顯示，設置時間顯示范圍、電壓表示范圍、譜 圖

6、顯示顏色、數據顯示內容，點擊“采用”按鈕。（4）在方法菜單欄點擊儀器信息，輸入相關儀器參數。（5）在通道菜單欄點擊數據采集，觀察流動相基線是否平穩待，基線平穩， 在檢測器通過“zero”鍵調零。標樣譜圖：用進樣針抽取相應量標品，把手動進樣器扳鈕按逆時針方向旋全 “load”處，將進樣針插入進樣孔，注入標液，注完將進樣器扳鈕按順時針方向 旋至“inject”處，同時點擊外帶按鈕或數據采集菜單欄“采集數據”按鈕。數 據采集完畢，自動積分，文件存于相應地址。樣品譜圖：在方法菜單欄點擊組分表，在對話框點擊譜圖按鈕，調入標樣譜 圖，通過鼠標拖動圈住對應峰，設定相關參數，點擊采用按鈕，用進樣針抽取相 應量

7、樣品，進樣方式同標樣。點擊采集按鈕，采集時間結束，文件存于設定地址。4、分析色譜圖在住界面點擊Reprogress進入界面后雙擊右側圖標后，打開文件，點擊所保 存的文件名既看到圖譜。點擊|（analysist）顯示保留時間和峰面積，記錄數據 做標準曲線。計算標準線性方程；待測樣品進樣后，記錄相同保留時間下的物質 峰面積，代入方程計算含量。5、關機試驗結束后用純甲醇將色譜柱沖洗干凈，一般用純甲醇沖洗13h，待記錄 儀上無雜質峰后關機，關閉穩壓電源。五、實驗結果濃度（mg/L）苯酚保留時間（min）苯酚峰面積 （mv）a萘酚保留時 間（min）a萘酚峰面積（mv）55.8701088517.817

8、11832105.8852071217.84322597205.8383952617.81042753406.3938595319.47284744606.39513234219.53111818806.37720167019.1282112661006.26321893319.343249168樣品繪制苯酚、a萘酚標準曲線。六、注意事項流動相的制備要與裝置相適應，必須經過過濾、脫氣并恢復到室溫后使 用，以防氣泡的產生；樣品溶液進樣前必須用0.45 Mm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損；轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵 內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力，再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損 壞；為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。 通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗；輸液泵的壓力必需穩定，才能取得良好的分析結果。變動的幅度大致在 0.5MPa以內范圍為正常；在一段時間內不進行分析時，建議清洗柱子，并從裝置