1、    甲3(H3N2)亞型流感病毒相變異分子生物學基礎的研究        【摘要】目的弄清甲3(H3N2)亞型流感病毒相變異的分子生物學基礎。方法病毒粒RNA經逆轉錄合成cDNA，經聚合酶鏈反應(PCR)擴增，產物純化，采用雙脫氧鏈末端終止法進行核苷酸序列測定。結果35株甲3(H3N2)亞型流感病毒的HA1區基因長度均為984個核苷酸，它們間無發生任何核苷酸丟失或插入并發現HA1蛋白分子上氨基酸序列多變點主要在HA蛋白的頂部，尤其抗原決定簇B區和受體結合部位(RBS)，這

2、進一步證實了，HA蛋白分子上氨基酸替換主要是人群免疫壓力所造成。同時還發現了半胱氨酸和脯氨酸具有高保守性及糖基化位點主要集中在HA1區的N和C端，尤其N端。糖基化位點如此分布在病毒基因進化和流行病學上意義至今不清楚。結論H3N2亞型病毒“O”相毒株的出現與其蛋白分子上第226位氨基酸發生替換密切相關并推測“O”相毒株HA蛋白三維結構與“D”相的不同。【主題詞】流感病毒核苷酸序列相變 Studies on the basis of molecular biology of the phase change of influenza A(H3N2) virusesGuo Yuanji, Dong

3、Jie, Wang Min, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing100052AbstractThe analysis of nucleotide sequences on HA1 domain of 35 strains of influenza A(H3N2) virus showed that their HA1 genes all were 984 nucleotides in length coding for a HA1 protein with 328 amino

4、 acides and there was not any occurrence of insertion or deletion of nucleotides on HA1 genes among them. The appearance of “O” phase strain of influenza A(H3N2) virus was closely related with substitution at 226 position of amino acid on HA1 protein molecule and the three-dimensional structural cha

5、nge of HA protein. The results in this paper indicaded that the positions with multiple changes on HA1 protein molecule located at the top of HA protein, especially at antigenic determinant B site or receptor binding site. These further demonstrated that the substitution of amino acid on HA1 protein

6、 molecule was casued mainly by suppress of herd immunity. This study also showed that the position of the cysteine and proline residues on the HA1 protein molecule were conservative and that the glycosylation sites located at N and C terminals, especially at N terminal of the HA1 protein The signifi

7、cance of such a distrib of glycosylation sites in the evolution of viral genes and epidemiology still remain unknown.Key words：Influenza A(H3N2) virusUtion Phase change相變是甲型流感病毒變異的一種形式1，但一般認為甲2(H2N2)和甲3(H3N2)亞型毒株不具有“O”相特性，它們可直接通過雞胚尿囊腔分離出并能凝集雞紅細胞。1996年初，我們在流感監測中發現了具有“O”相特性的甲3(H3N2)亞型流感病毒株2。由于這屬首次發現，故

8、有必要弄清其出現的分子生物學基礎。甲型流感病毒基因組含8個節段，至少編碼10種蛋白，但它們是依靠其毒粒表面血凝素，(HA)蛋白抗原來識別和結合紅細胞表面含唾液酸的糖蛋白或糖脂的受體。導致了紅細胞的凝集。Weis等3采用x-射線分析法弄清了HA蛋白結合唾液酸區的結構。Nobusawa等4觀察到了HA蛋白受體結合部個別氨基酸替換就能直接影響HA蛋白對紅細胞結合的能力。故我們測定了1979年以來H3N2亞型毒株HA1區基因的核苷酸序列并分析和比較其產物的氨基酸序列，以便弄清H3N2病毒“O”相毒株出現的分子生物學基礎。1材料和方法1.1甲3(H3N2)亞型毒株的來源見表1。除A/Bangkok/1/

9、79(H3N2)由WHO提供外，其余均來自國家流感中心。1.2病毒增殖“D”相毒株按常規法接種9-11日齡雞胚尿囊腔進行增殖，收尿囊液，細菌培養陰性，雞紅細胞凝集滴度40者；“O”相毒株，按常規接種MDCK細胞，收其細胞維持液，細菌培養陰性，對豚鼠紅細胞凝集滴度40者。1.3“O”、“D”相轉變將具有“O”相特性的A/京科/32/96(H3N2)和A/京科/18/96(H3N2)兩毒株經雞胚尿囊腔適應傳代，當所收獲的尿囊液對胚鼠和雞紅細胞凝集能力相同時，再經雞胚尿囊腔傳兩代即為已從“O”相轉變成“D”相。1.4病毒濃縮和純化1992年及之前分離的病毒在提取RNA之前，均按常規在雞胚增殖后，所收

10、獲的新鮮尿囊液，經超速離心進行濃縮，用30%60%的蔗糖梯度離心進行純化。1.5病毒粒RNA提取1992年及之前所分離毒株提取法見參考文獻5。1992年之后所分離毒株RNA提取，采用德國1995年出品的RNeasy RNA Kit，方法按QIAquickTM Handbook所提供的。1.6引物用于cDNA合成和PCR擴增的有：F7(5d-ACTATCATTGCTTTG)和R1073(5'd-CCTGCGATTGCGCCGAAT)；用于序列測定的有：25(5d-TACATTTTCTGTCAG),145(5'd-GGTAGAATATGCGACAGT),282(5'd-CA

11、GCAACTGTTACCC),490(5'd-CTGAACGTGACTATG);721(5'd-GACATACTGTTGATT),814(5'd-GACCCCATTGGCACCTGC),R362(5'd-TAAGGGTAACAGTTGCTG)和F7。35S-ATP，逆轉錄酶，PCR試劑盒，PCR產物純化試劑盒以及Sequence system試劑盒均由美國CDC提供。表1本研究所用的甲3(H3N2)亞型流感病毒株Tab.1Influenza A(H3N2) viruses examined in the current study病毒Viruses簡稱Abbre

12、viation相PhaseA/Bangkok/1/79Bang 79-1DA/Yaan/2/87YA 87-2DA/Shanghai/11/87SH 87-11DA/Beijing/57/89BJ 89-57DA/Shanghai/1/89SH89-1DA/Sichuan/18/89SC 89-18DA/Guangdong/16/89GD 89-16DA/Guangdong/44/89GD 89-44DA/Jinan/15/90JN 90-15DA/Wuhan/7/90WH 90-7DA/Shanghai/24/90SH 90-24DA/Beijing/32/92BJ 92-32DA/Beij

13、ing/46/92BJ 92-46DA/Beijing/47/92BJ 92-47DA/Beijing/361/92BJ 92-361DA/Sichuan/3/92SC 92-3DA/Sichuan/10/92SC 92-10DA/Guangdong/1/92GD 92-1DA/Shandong/9/93SD 93-9DA/Guangdong/25/93GD 93-25DA/Johannesbury/33/94Joh 94-33DA/Guangxi/13/94GX 94-13DA/Guangdong/274/94GD 94-274DA/Beijing262/415/94BJ 94-415DA/

14、Wuhan/359/95WH 95-359DA/Shenzhen/203/95SZ 95-203DA/Shanghai/9/95SH 95-9DA/Shanxi/28/95SX 95-28DA/Fujian/57/96FJ 96-57DA/CNIC/3/96CNIC 96-3OA/CNIC/10/96CNIC 96-10OA/CNIC/32/96CNIC 96-32DA/CNIC/32/96CNIC 96-32OA/CNIC/18/96CNIC 96-18DA/CNIC/18/96CNIC 96-18O     1.7cDNA合成和聚合酶鏈反應見文獻6。

15、1.8PCR產物純化按德國出品的，QIAguick PCR Purification Kit所提供的方法。1.9核苷酸序列測定采用雙脫氧鏈終止法7，基本步驟參考USB公司DNA sequence試劑盒。 2結果35株測定病毒，其HA1區基因長度均為984個核苷酸，它們彼此間無發生任何核苷酸插入或丟失。現將所測定的核苷酸序列所推導出的相應氨基酸序列列于1。    135株甲3(H3N2)亞型流感病毒HA1區氨基酸序列虛線示氨基酸序列同WH95-359；黑線示糖基化位點Fig. 1Deduced amino acid sequence of the HA1

16、gene of influenza A(H3N2) virusesThe dot line in dicates the amino acid sequence is identical with that of WH95-359 virus. The black line means the glycosylation site1結果表明，所有測定毒株HA1區蛋白分子均含328個氨基酸，它們之間共有52個位點發生了替換，保守位點與變異點之間比例為32852=5.31。發生兩次或兩次以上替換的位點共有9個：124(抗原決定簇A區)，133(RBS前壁)，156(抗原決定簇B區)，186(緊挨R

17、BS)，189(抗原決定簇B區)，193(緊靠RBS后壁)，197(抗原決定簇B區)，226(RBS左側壁)，262(靠近抗原決定簇E區)。上述位點除124和262外，其余7個均位于HA蛋白三維結構頂部。清楚表明了HA1區蛋白分子上氨基酸的替換主要是由于人群免疫壓力所造成。從1還可看出，所有半胱氨酸(C)位點均未發生替換，表明它們相互間雙硫鍵是相同的，同時所有脯氨酸(P)位點也均相同。此外，糖基化位點，除了BJ96-32和BJ96-32于122位插入一個及BJ96-32和BJ96-18在246位丟失一個糖基化點外，測定的其余毒株均有共同8個糖基化位點，它們位于8，22，38，63，126，16

18、5，246和285。糖基化位點主要分布在HA1蛋白分子的兩頭，尤其集中在N端。從1結果很有意義地發現了第226位氨基酸，自1995年以來所分離出的毒株均為“”(異亮氨酸)，而1995年以前的毒株不是“L”(亮氨酸)就是“Q”(谷氨酰胺)。然而，在1995年所分離的“O”，“D”相毒株間見不到第226位氨基酸有差異。通過實驗室誘導兩組病毒間，僅在其246位點上，“O”相毒株為“N”(天冬酰胺)而“D”相毒株為D(天冬氨酸)，造成一個糖基化位點的丟失。除此之外，見不到實驗誘導的“O”與“D”相毒株間有其它規律性的差異。3討論本研究表明，H3N2亞型流感病毒相特性的出現與其蛋白分子上第226位氨基酸

19、替換有密切相關。因它是RBS袋的左側壁重要成員。一般認為它的改變就能引起病毒粒HA蛋白與受體結合的特異性。同時根據國外過去所報道的資料9，10，無論是人，馬還是禽的H3亞型毒株，其HA1蛋白分子上第226位氨基酸不是“L”就是“Q”，從未出現過“I”。但1995年以來，無論“O”相還是“D”相毒株其HA1蛋白分子上第226位均為“I”，故看來，僅第226位氨基酸改變能引起病毒粒對受體特異性的改變，但還不夠完全導致H3N2亞型毒株相的改變，故推測在“O”與“D”相毒株間其HA蛋白三維結構方面存在著差異。雖然通過實驗誘導的“O”、“D”毒株間在第246位上氨基酸有差異，但在其它“O”、“D”相毒株

20、間見不到有相同的差異，同時第246位是位于HA蛋白抗原決定簇的D區，離RBS甚遠，故與病毒粒相變關系不密切。“C”與“P”殘基具有保守性，這與國外報道11，12是一致的。一般認為它們在維持HA蛋白三維結構中起著重要的作用13。為何糖基化位點主要集中在HA1蛋白的N和C端，尤其N端，這種分布在病毒基因進化中作用及在流行病學上意義至今不清楚。估計H3N2亞型病毒“O”相毒株于1995年就已出現，由于當時沒預計到，許多未分離出，分離到的也已經雞胚傳多代，已變成“D”相毒株。本文受國家自然科學基金資助(39670037)作者單位：100052北京中國預防醫學科學院病毒學研究所1997年10月24日收稿

21、1998年1月20日修回參考文獻1Andrewes S C, Pereira H G, Wildy P. Viruses of vertebrates. Fourth edition. London: Bailliere Tindall, 1978, 203-211.2郭元吉，趙惠芬，王敏，等. 流感病毒相變的發現及其意義. 中華實驗和臨床病毒學雜志，1996，10(2)：101-103.3Wei W, Brown J H, Cusack, et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complex with its recep

22、tor. Nature, 1988, 333: 426-431.4Nobusawa E, Nakajima. Amino acid substitution at 226 of the hemagglutinin molecule of influenza A(H1N1) affects receptor binding activity but not fusion activity. Virology, 1988, 167: 8-13.5Guo Y J, Desselberger D. Genome analysis of influenza C viruses isolated in 1

23、981/1982 from pigs in China. J Gen Virol, 1984, 65: 1873-1880.6Saiki R K, Gelfand D H, Stattels, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239: 487-492.7Cox N J, Kitame F, Klimov A, et al. Comparative studies of wild type and cold mutant

24、 (temperature-sensitive) influenza viruses: detection of mutation in all genes of the A/Ann Arbor/6/60(H2N2) mutant vaccine donor strain. Microbiol Pathogenesis, 1986, 1: 387-392.8Underwood P A. Receptor binding characteristics of strains of the influenza Hong Kong subtype, using a periodate sensitivity test. Archiv Virol, 1985, 84: 53-55.9Both G W, Sleigh M J. Conservation and variation in the hemagglutinin