1、粗糙鏈孢霉的四分子分析粗糙鏈孢霉的四分子分析 一、實驗目的一、實驗目的1、了解粗糙鏈孢霉的雜交方法；、了解粗糙鏈孢霉的雜交方法；2、通過、通過Lys和和Lys雜交后代表現型的分析，雜交后代表現型的分析，了解順序四分子的基因作圖方法；了解順序四分子的基因作圖方法；3、加深分離和交換定律的理解，了解基因轉變、加深分離和交換定律的理解，了解基因轉變現象。現象。 二、實驗原理二、實驗原理u粗糙鏈孢霉粗糙鏈孢霉 ( Neurosporocrassa ) 屬真菌的子囊菌屬真菌的子囊菌綱。兩種不同接合型菌株的結合受一對等位基因綱。兩種不同接合型菌株的結合受一對等位基因控制，可驗證分離規律。控制，可驗證分離規

2、律。u利用粗糙孢霉利用粗糙孢霉Lys和和Lys雜交，野生型孢子成熟雜交，野生型孢子成熟較早，缺陷型子囊孢子成熟較遲的特點，觀察雜較早，缺陷型子囊孢子成熟較遲的特點，觀察雜交后代的表型并進行分析交后代的表型并進行分析 ，可用于著絲粒作圖。，可用于著絲粒作圖。粗糙鏈孢霉的生活周期粗糙鏈孢霉的生活周期（接合型與高等動植物中性別的不同）（接合型與高等動植物中性別的不同）四分子分析用于驗證基因分離規律四分子分析用于驗證基因分離規律（Lys+Lys+） （Lys-Lys-） 合子（合子（+/-+/-） 子囊孢子子囊孢子1 1：1 1分離：分離：4 4個黑色（個黑色（+ +） 4 4個灰色（個灰色（- -）

3、順序四分子分析用于著絲粒作圖順序四分子分析用于著絲粒作圖目的基因與著絲粒之間發生重組目的基因與著絲粒之間發生重組1、著絲粒為、著絲粒為M1分離分離2、目的基因的分離、目的基因的分離 M1分離：目的基因與著絲粒之間未發生重組，分離：目的基因與著絲粒之間未發生重組，產生非重組型子囊產生非重組型子囊M2分離：目的基因與著絲粒之間發生重組，產分離：目的基因與著絲粒之間發生重組，產生重組型子囊生重組型子囊lys C交換型子囊與非交換型子囊的形成交換型子囊與非交換型子囊的形成非交換型子囊非交換型子囊 M1交換型子囊交換型子囊 M2目的基因在目的基因在M1分離，產生非重組型子囊分離，產生非重組型子囊目的基因

4、在目的基因在M2分離，產生重組型子囊分離，產生重組型子囊 + + + + - - - -+ + - - + + - - - + + - - + + - - + + + + - -+ + - - - - + + 非正常分離子囊非正常分離子囊基因轉換：一個基因在聯會過基因轉換：一個基因在聯會過程中受到等位基因的影響而發程中受到等位基因的影響而發生變化。基因轉換總是伴隨著生變化。基因轉換總是伴隨著染色體之間的交換染色體之間的交換M后分離：后分離：基因轉換基因轉換產生不正常分離子囊產生不正常分離子囊著絲粒和基因之間的重組值的計算著絲粒和基因之間的重組值的計算 基因與著絲粒之間的圖距為去掉的重組值基因與

5、著絲粒之間的圖距為去掉的重組值M2分裂分離子囊數分裂分離子囊數子囊總數子囊總數1/2100%三、實驗用品三、實驗用品1、材料：粗糙鏈孢霉野生型菌株，、材料：粗糙鏈孢霉野生型菌株，Lys+。 粗糙鏈孢霉賴氨酸缺陷型菌株，粗糙鏈孢霉賴氨酸缺陷型菌株，Lys-。2、藥品：、藥品：瓊脂、蔗糖、玉米粒、土豆、瓊脂、蔗糖、玉米粒、土豆、 5次次氯酸鈉（氯酸鈉（NaClO）、）、5石碳酸。石碳酸。3、器具：顯微鏡、鑷子、解剖針、接種針、載玻片、器具：顯微鏡、鑷子、解剖針、接種針、載玻片、試管、培養皿試管、培養皿 、 恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、濾恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、濾紙、三角瓶、水浴鍋。紙、三角瓶、水浴鍋。

6、四、實驗操作流程四、實驗操作流程1、菌種活化、菌種活化 ：將：將Lys和和Lys菌株分別接種在完全培養基上，菌株分別接種在完全培養基上，28培養培養5d左右。左右。2、雜交、雜交 ：將兩種親本菌株分生孢子或菌絲接種到雜交培養基：將兩種親本菌株分生孢子或菌絲接種到雜交培養基上，培養上，培養57d，形成黑色子囊果。，形成黑色子囊果。3、子囊果處理：在有子囊果的試管中加少量無菌水，搖動片、子囊果處理：在有子囊果的試管中加少量無菌水，搖動片刻，把水倒入三角瓶中，小組集中煮沸，防止孢子飛揚。刻，把水倒入三角瓶中，小組集中煮沸，防止孢子飛揚。4、顯微觀察：取一載玻片，加、顯微觀察：取一載玻片，加12滴滴5

7、次氯酸鈉，用接種次氯酸鈉，用接種環挑出子囊果，放在載玻片上，用另一載玻片蓋上，用手環挑出子囊果，放在載玻片上，用另一載玻片蓋上，用手指壓片，壓破子囊果，在低倍鏡下觀察。指壓片，壓破子囊果，在低倍鏡下觀察。五、實驗結果與分析五、實驗結果與分析1、觀察一定數目的子囊果，記錄每個完整子囊的類型，計算、觀察一定數目的子囊果，記錄每個完整子囊的類型，計算Lys基因與著絲粒距離。基因與著絲粒距離。 2、記錄你所觀察到的基因轉變現象。、記錄你所觀察到的基因轉變現象。思考題：思考題：1 1、用圖表示第六種子囊類型的形成。、用圖表示第六種子囊類型的形成。2、假設在基因與著絲點之間發生了雙交換，你的數據和計算假設

8、在基因與著絲點之間發生了雙交換，你的數據和計算結果會發生怎樣的偏差？結果會發生怎樣的偏差？實驗結果實驗結果子囊類型子囊類型觀察數量觀察數量 （5:3） （3:5） （6:2） （2:6） （4:4不正常）不正常）（糞殼菌子囊孢子顏色遺傳）糞殼菌子囊孢子顏色遺傳）0.060.050.0085:36:2不規則 4:4正常正常 4 : 4 98.825:35:3、3:53:5或或6:26:2、2:62:6或或3:13:1、1:31:3都都屬于不規則，屬于不規則，說說明減數分裂的明減數分裂的4個個產物中，一個基產物中，一個基因轉變為另一等因轉變為另一等位基因位基因基因轉變現象。 rare except

9、ions有時出現如圖結果有時出現如圖結果參考結果參考結果六、注意事項六、注意事項1、菌種活化及雜交要注意無菌操作。、菌種活化及雜交要注意無菌操作。 2、賴氨酸缺陷型接種在完全培養基上生長不好，、賴氨酸缺陷型接種在完全培養基上生長不好，需要加適量賴氨酸。需要加適量賴氨酸。3、雜交后培養溫度要控制在、雜交后培養溫度要控制在25；30以上抑制以上抑制原子囊果的形成。原子囊果的形成。4、用過的載玻片、鑷子和解剖針等物都需放入用過的載玻片、鑷子和解剖針等物都需放入5 5的石碳酸中浸泡后取出洗凈，以防止污染實驗室。的石碳酸中浸泡后取出洗凈，以防止污染實驗室。 5、注意觀察選擇的時間、注意觀察選擇的時間 L

10、ys子囊孢子成熟較遲，當子囊孢子成熟較遲，當Lys子囊孢子已子囊孢子已成熟呈黑色時，成熟呈黑色時， Lys子囊孢子還呈灰色，如果觀子囊孢子還呈灰色，如果觀察時間過早，所有的子囊孢子都未成熟，全為灰察時間過早，所有的子囊孢子都未成熟，全為灰色；觀察過遲，色；觀察過遲， Lys子囊孢子也已成熟，全為黑子囊孢子也已成熟，全為黑色，就不能分清各種子囊類型。色，就不能分清各種子囊類型。6、注意基因轉變現象、注意基因轉變現象 偶爾觀察到偶爾觀察到6 2、2 6、5 3、3 5或異常或異常的的4 ：4等分離比，是基因轉變造成的。基因轉變等分離比，是基因轉變造成的。基因轉變的頻率一般在的頻率一般在1%左右。左右。 培養基的配制培養基的配制 馬鈴薯培養基（基本培養基）：馬鈴薯培養基（基本培養基）：也可以代替完全培也可以代替完全培養基。將馬鈴薯洗凈去皮，切碎，取養基。將馬鈴薯洗凈去皮，切碎，取200g，加水，加水1000ml，煮熟，然后用紗布過濾，棄去殘渣，濾下的汁加煮熟，然后用紗布過濾，棄去殘渣，濾下的汁加2瓊瓊脂，脂，20g蔗糖，煮融，分裝到試管中。或將馬鈴薯切成蔗糖，煮融，分裝到試管中。或將馬鈴薯切成黃豆大小的碎塊，每支試管放黃豆大小的碎塊，每支試管放3-4粒，再加入融化好的瓊粒，再加入融化好的瓊脂、蔗糖。消毒后取出