1、對蝦白斑綜合癥病毒與黃頭病毒雙重快速檢測試紙條摘要：雙重檢測白斑綜合癥病毒(WSSV)和黃頭病毒(YHV)試紙條是建立于特定地對WSSV包膜蛋白VP28(W1和W30)和YHV核殼體蛋白p20(Y19和Y21)的使用單克隆抗體(MAbs)上。單克隆抗體W30和Y19與膠體金結合并噴到緊挨玻璃纖維墊的樣品小室內。單克隆抗體W1和Y21羊抗鼠免疫球蛋白G(GAM)抗體被分別噴到硝化纖維膜條的位置指定W,Y和C。這些試紙條被干燥存儲在一個塑料袋里并放置在塑料盒子中。取對蝦的游泳足作為樣本，來評估試紙條對WSSV和YHV的檢測能力。將游泳足勻漿在100l緩沖液中，并置于試紙條的樣品小室中，順著消化纖維

2、膜條流動，并可以在15分鐘內被觀察到抗體蛋白復合物。樣本中蝦被WSSV和(或)YHV感染,病毒蛋白將會結合到膠體金單抗上。這些復合物會被在測試線W和（或）Y上的單抗俘獲,造成外觀可見的顏色帶。任何未結合膠體金單抗的，就會通過W和Y線，被GAM抗體俘獲,在C處形成條帶。當樣本不包含WSSV和YHV蛋白質或含量低于檢測下限的病毒蛋白的測試，只能C處觀測到條帶。靈敏性測試與使用單一單抗斑點印跡試驗相對比，500倍的敏感度低于對WSSV的1-step PCR和1000倍的敏感度低于對YHV的RT-PCR。盡管如此低靈敏度,雙重檢測試紙條在速度、簡單的操作和在不需要復雜的設備或專業技能依然具有優勢。而且

3、此試紙條能同時檢測WSSV和YHV的能力也節約了花銷。1. 背景介紹白斑綜合征病毒（WSSV）和對蝦黃頭病病毒（YHV）是對蝦商品化養殖中最常見的具有高傳染性的病毒。這些病毒已經造成非常嚴重的經濟損失，尤其在泰國，過去十年里它們已經導致了10億美元的損失(Flegel, 2006)。各種分子方法已經開發來用于這些病毒的診斷，包括對WSSV的PCR分析(Takahashi et al., 1996; Lo et al.,1996; Srisala et al., 2008)；對YHV的RT-PCR分析（Wongteerasupaya et al.,1997; Cowley et al., 200

4、4）；對YHV的qRT-PCR分析（Dhar et al., 2001; Ma et al., 2008）；對WSSV的環介導等溫擴增（LAMP）（Jaroenram et al., 2009）和對YHV的RT-LAMP（Mekata et al., 2009)）。這些方法中，PCR和qPCR由于其高的靈敏度和特異性，已用于廣泛用于檢測和研究。免疫學為基礎的同時使用多克隆抗體（PABS）和單克隆抗體（MAbs）的診斷方法，已經開發了用于WSSV檢測（Nadala et al., 1997; Nadala and Loh, 2002; Poulos et al., 2001; Anil et a

5、l., 2002; Liu et al., 2002; Chaivisuthangkura et al., 2004, 2010）和YHV的檢測（(Nadala et al., 1997; Sithigorngul et al., 2000, 2002）。然而，這些免疫學為基礎的技術，只能在實驗室由訓練有素的人員執行。這些技術的進一步優化令到免疫層析法試紙條發展到可以進行對WSSV的檢測（Powell et al., 2006; Sithigorngul et al., 2006）和對YHV的檢測（Sithigorngul et al., 2007）。這些試紙條的特性是其簡單性和便利性；結果可

6、以迅速地獲得，不需要復雜的工具或專業技能。此外，這種方法可用于篩選個別蝦或養殖池中的蝦樣品來確認相對高水平的病毒感染（相比于基于PCR的方法）。且可以方便地用于由養殖戶自己監控兩種病毒的感染情況。在被用于檢測WSSV與YHV的開發的單一檢測試紙條中（Sithigorngul et al., 2006, 2007），被用作俘獲抗體的多抗作為測試條的測試線的主要組成部分。除了數量上的控制上，多抗在質控上明顯地要比單抗要不可靠。在這份報告中，新的針對WSSV的單抗（W1和W30）和針對YHV的單抗（Y21）會替代多抗更加有效地作為試紙條的檢測線（Sithigorngul et al., 2006,

7、2007）；并且原本檢測兩種病毒的兩條試紙條會被整合到一條雙重檢測的試紙條上，以更加方便地使用單一制劑檢測兩種病毒。2. 材料和方法2.1病毒的準備從泰國中部佛統府挽鈴縣的農場獲得的稱重過后1015g的南美白對蝦（凡納濱）對蝦自然感染YHV。從泰國南部宋卡和Prajuabkirikhan省的農場獲得，1015g并稱重的南美白對蝦自然感染WSSV。從被感染的蝦截取了兩游泳足，勻漿并加入100l 0.3M磷酸鹽緩沖鹽水（2×PBS中，pH值7.2）和0.5ml等分上清液。在實驗前，將這些勻漿貯存在70 C。2.2單克隆抗體的準備如前所述，對WSSV包膜蛋白VP28（W1，W30）具有特異

8、性的單抗，是從免疫的小鼠中免疫并重組得到的（Chaivisuthangkura et al., 2004）。而對YHV核殼蛋白P20（Y21）具有特異性的單抗從小鼠免疫后部分純化后得到的（Sithigorngul et al., 2002）。對YHV p20 具有特異性的Mab（Y19）先前已經描述過了（Sithigorngul et al., 2002）。用雜交瘤-SFM 無血清培養基（Gibco, Carlsbad, CA, USA）培養產生MAbs的雜交瘤，并且按照生產商的說明使用瓊脂糖凝膠柱（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN,

9、 USA）純化MAbs。用磷酸鹽緩沖液（PB：10mM磷酸緩沖液，pH7.3）對洗脫的抗體進行透析，并且將抗體濃度調至1mg / ml。2.3斑點印跡試驗分別用來自未感染的對蝦游泳足勻漿稀釋感染了WSSV或YHV的對蝦游泳足勻漿，并將稀釋液點到硝酸纖維素膜上。如前所述，將硝酸纖維膜置于包含對WSSV或YHV具特異性的單抗溶液中，并且此 單抗能與病毒蛋白結合后能被檢測到（Sithigorngul et al., 2002; Chaivisuthangkura et al., 2004）。在使用成對抗體時，任何觀察到的測試靈敏性的上升都表明MAbs與非重疊抗原結合。2.4. 免疫層析試紙條的準備雙

10、重檢測試紙條是從Pacific Biotech Co. Ltd（泰國，碧差汶省）購置的。單抗 W30和Y19需與膠體金顆粒（直徑10nm）進行聚合，并以5和3l/cm的規格噴在玻璃纖維墊上，而且在使用前需要在40下干燥保存過夜。單抗W1（0.4mg/ml）和Y 21（1mg/ml）是各自連續地以1和1.5l/cm的規格微噴到硝酸纖維素膜（孔徑：8-m）特定地位置。這些特定的位置就是試紙條上的用于檢測WSSV的W線和用于檢測YHV的Y線（圖.1A）。羊抗鼠IgG抗體（0.8mg/ml）以1l/cm的規格噴到相同的硝酸纖維膜上作為質控線C的地方。然后將膜置于40下干燥過夜。組裝時，玻璃纖維墊與噴有

11、結合了膠體金的W29和Y19硝酸纖維膜接合時，應在其反面并置于質控線的下游處。樣本墊置于玻璃纖維膜前方樣本小室處。吸收墊置于在最末端，緊靠著質控線以收集最后多余的待測液（圖. 1A）。這些組件被切割成4.5mm寬的試紙條，裝于一獨立的塑料小盒子中（圖.1C），最后貯存在干燥的塑料袋子中。2.5. 特異性檢測從未感染或自然感染WSSV或YHV的南美白對蝦中取其游泳足（1015g），并在PBS（50l/游泳足）作勻漿處理。然后，此勻漿用1:5的緩沖液（30mM Tris，336mM NaCl，9nM EDTA，1% Triton X-100，pH=9.3）稀釋。取其稀釋后的上清液100l并置于單獨

12、的試紙條的樣本小室中，讓其像色譜那樣，到達吸收墊前，在試紙條的硝酸纖維流動流至W，Y和C處（圖.1B）。在15min內即可觀察到樣本在試紙條上的試驗結果。若是陽性，則在W和（或）Y處與C處出現紅紫色的條帶，而若是陰性則只在C處出現紅紫色條帶（圖.2）。感染了WSSV和YHV的對蝦游泳足勻漿液可以以1:1的比例進行同樣的的實驗。為了確定其特異性，從感染了桃拉綜合征病毒（TSV）或皮下及造血組織壞死病病毒（IHHNV）的蝦去其游泳足以相同的方法作了實驗。以確定兩種病毒與單抗結合時可能造成的干擾，在進行試紙條靈敏度檢測對比實驗前，感染WSSV的對蝦游泳足勻漿分別與從感染YHV或未感染的對蝦游泳足勻漿

13、進行稀釋。相反地，感染YHV的勻漿則與感染WSSV或未感染的對蝦游泳足勻漿分別稀釋，并以相同的方式進行實驗。2.6. 試紙條與斑點印跡試驗和PCR的靈敏性對比從感染了WSSV或YHV的南美白對蝦游泳足勻漿中取上清液，并分別用未被感染的南美白對蝦游泳足勻漿稀釋（用斑點印跡試驗的PBS或試紙條和PCR的應用緩沖液）。從每個稀釋液中取1l作為樣品，并像之前描述的單抗對WSSV或YHV特異性測試那樣，用斑點印跡試驗來試驗。用高純度核酸試劑盒（羅氏分子生物化學試劑）從相同對蝦的勻漿中（100l）中提取的，并且用未感染對蝦中提取的核酸分別進行稀釋。這些樣本用于證明其是否含有WSSV 的DNA或YHV的RN

14、A。用引物VP28F和VP28R進行PCR，得到長度為633bp的擴增子（Chaivisuthangkura et al., 2004）證明其含有WSSV的DNA；用設計好的引物YHV10F和YHV114R進行RT-PCR，得到長度為135bp的擴增子（Wongteerasupaya et al.,1997）來證明其含有YHV的RNA。如上所述，相同的稀釋核酸樣本分裝后同樣用于試紙條試驗。用其他檢驗靈敏度的方法與其通過瓊脂凝膠電泳產生DNA的最低稀釋濃度方法來對比。2.7. 熱穩定性測試經過干燥處理保存在塑料袋的免疫層析試紙條置于60的烘箱中，在使用前分別存放0,10，20和30天。用混合了感

15、染了WSSV和YHV的南美白對蝦游泳足勻漿以1:5和1:100的比例稀釋后對試紙條進行試驗（每次試驗使用5片試紙條）。用未感染南美白對蝦游泳足勻漿得到的質控線條帶強度與其免疫條帶強度作對比。圖1：試驗試紙條。（A）圖中示出雙重檢測試紙條中各單抗的位置。（B）含有WSSV和YHV的樣本到達樣本墊后，檢測線（W和Y）上的抗體將俘獲結合了抗體和抗原的復合物，并在W和Y處顯示出紅紫色的膠體金條帶。而未被結合的抗體則會越過檢測線，在C處卑羊抗鼠IgG抗體（GAM）所俘獲并出現一條條帶。樣本的其余成分則被吸收墊所吸收。（C）中圖片顯示的是打開包裝盒測試前的雙重檢測試紙條。（D）則顯示的是包裝試紙條的小盒子

16、。黃色的正方形和藍色三角形代表對蝦的組織。（在該圖中說明的參考顏色的解釋，讀者可參考該文章的網頁版本。）圖2：雙重測試試紙條實驗結果。對蝦游泳足勻漿樣本：（A）未感染病毒的對蝦；（B）感染了WSSV的對蝦；（C）感染了YHV的對蝦；（D）將B和C混合。W：檢測WSSV的檢測線，Y：檢測YHV的檢測線，C：質控線。3. 結果3.1. 對WSSV和YHV特異性MAbs的生產兩組對WSSV 的VP28具有特異性的單抗（W1和W30）是從免疫過的小鼠中得到后并將VP28蛋白（rVP28）重組。這兩組結合在VP28不同位置的單抗顯示出相同水平地親和力。這兩種單抗的結合使用令到斑點印跡檢測靈敏度增加了2倍

17、（圖.3A）。相反地，單體W30通過單抗W29結合到到該重疊表位，基于該發現，這兩種單抗的結合并未增加斑點印跡試驗檢測的靈敏度（數據未顯示）。因此，如上所述，對于免疫層析試紙條，將與膠體金結合的單抗W30替代單抗W29和W1置于檢測線上并替代檢測WSSV試紙條上兔抗-rVP28與單抗W28的合用（Sithigorngul et al., 2006）。對YHV p20具有特異性的單抗Y21表現出與單抗Y19相同的檢測靈敏度，并且當它們一起使用時，斑點印跡試驗的檢測靈敏度增加了2倍（圖.3B）。如先前報告的描述，為了使其優化，在試紙條的檢測線上使用單抗Y21而不使用單一檢測YHV試紙條中重組p20

18、的多抗（Sithigorngul et al., 2007）。3.2. 試紙條的優化在生產雙重檢測試紙條的最后優化中，單抗W30（5l/cm）和單抗Y19（3l/cm）與膠體金顆粒結合，分別噴到每條試紙條的玻璃纖維墊上。對于檢測線和質控線，單抗W1（0.4mg/ml），單抗Y21（1mg/ml）和羊抗鼠（0.8mg/ml）以1,1.5和1l/cm的規格分別噴到硝酸纖維膜的W，Y和C處，并且因為這些單抗表現出其對稀釋了的感染病毒的對蝦樣本高度的靈敏性，以致即使是未被感染的對蝦樣本也不會顯示出假陽性。3.3. 試紙條的特異性檢驗當感染了WSSV或者YHV的對蝦樣本被用作檢測時，只能觀察到一條色帶在

19、W或Y線上。可以觀察到，在兩種病毒之間或者其他對蝦病毒間，如TSV和IHHNV，并沒有出現交叉反應。當使用感染了這兩種病毒的對蝦樣本混合物，在W和Y處都可以觀察到條帶，而互相之間不發生任何干擾（圖.2）。此外，該病毒在病毒混合物的病毒含量比與另一病毒低得多，檢測靈敏度仍類似于含有一種病毒勻漿樣品的相同效價（圖.4）。這個試紙條可以檢測在東南亞發現的的強毒株YHV-1a和YHV-1b（Senapin et al., 2010）以及在澳大利亞發現的與鰓相關的病毒（GAV或YHV-2）（Sithigorngul et al., 2007）。圖3：對感染了WSSV和YHV的對蝦進行的斑點雜交試驗結果。

20、感染了WSSV（A）或YHV（B）的南美白對蝦游泳足勻漿用未被感染的對蝦游泳足勻漿稀釋，并且添加到硝酸纖維膜上（1l/點），單抗極限檢測值：W1（a），W30（b），W1和W30的組合（c），Y21（d）和Y19和Y21（f）（箭頭指的地方）。底下的方形顯示的是未被感染的南美白對蝦游泳足勻漿檢測結果。右側的數字表示每個樣品的稀釋數。3.4. 靈敏性測試感染了WSSV的對蝦勻漿所能顯示出明顯的陽性結果的最低比例是1:200（圖.5A）。靈敏性與用單一兩倍的單抗進行的斑點雜交測試相同，且低于用結合了W1和W30的單抗（1:400）的斑點雜交測試（圖.3A）。為了與PCR的靈敏性比較，從相同對蝦勻漿

21、中提取得核酸用于斑點雜交測試和試紙條檢測。在稀釋度10-5時，可以檢測到633bp的條帶（圖.6A）。因此，雙重檢測試紙條的靈敏度比one-step PCR低500倍。然而，雙重檢測試紙條在檢測WSSV的靈敏性上卻比單測試WSSV試紙條明顯地靈敏100倍（Sithigorngul et al., 2006）。相反地，感染了YHV對蝦游泳足勻漿得到明確的陽性結果的多滴比例是1：800（圖.5B）。此靈敏度與用單一單抗進行斑點雜交試驗相同，但是只有用Y19和Y21的混合單抗靈敏度的一半（圖.3B）。為了將它的靈敏度與用RT-PCR的靈敏度相比較，用RT-PCR對從同一對蝦游泳足勻漿分離出的核酸進行

22、試驗。在稀釋度為10-6的稀釋液中，可以檢測到135bp的淺帶（圖.6B）。因此，雙重檢測試紙條的靈敏度比one-step RT-PCR的低1000倍。3.5. 熱穩定性測試在60用游泳足勻漿，在稀釋比為1:5進行熱穩定性測試，顯示免疫反應條帶強度在0,10和20天孵育后并無差異。但是30天的孵育期后，其強度有輕微的下降。然而，在1:100稀釋液中，可以觀察到處理樣品中免疫條帶的強度并無差異。這結果表明，這試紙條可以在室溫下儲存至少兩年并且可以保持其功能不變（Paek et al., 2000），這跟單一測試WSSV（Sithigorngul et al., 2006）或YHV（Sithigo

23、rngul et al., 2007）的試紙條的保質期一樣。圖4：同一勻漿的WSSV與YHV干擾性測試。分別用南美白對蝦感染了YHV的游泳足勻漿（A）或未感染的（B）稀釋感染了WSSV的游泳足勻漿。相反的實驗則分別用南美白對蝦感染了WSSV的游泳足勻漿（C）或為感染的（D）稀釋感染了YHV的游泳足勻漿。它們被加到試紙條上的體積為100l/條。稀釋勻漿的稀釋度為1:5.并且用于稀釋的勻漿稀釋比例顯示在左側和右側。圖5：試紙條檢測WSSV和YHV靈敏度測試。感染了WSSV或YHV的南美白對蝦游泳足勻漿分別用未感染的對蝦游泳足勻漿來稀釋并且添加到試紙條的體積為100l/條。箭頭給出的為極限檢測出WS

24、SV（A）和YHV（B）的稀釋比例。注意：當使用這樣品15分鐘后薄膜還是濕潤時，能后觀察到檢測出WSSV為陽性結果的稀釋比例為1:200和檢測出YHV的為1:800。4. 討論測檢WSSV和YHV的雙重免疫層析試紙使用對WSSV具特異性的VP28和對YHV具特異性的p20來研制。實驗的檢測靈敏度與之前單一檢測YHV的試紙條（Sithigorngul et al.,2007）相同，并比之前單一檢測WSSV試紙條（Sithigorngul et al., 2006).）的要高。初步實驗表明，組合使用3種不同的VP28單抗并將任一置于W檢測線上，或者結合了膠體金，都不會增加其對WSSV的檢測靈敏度。

25、的確，與單獨使用單抗W1對比，將單抗W28用于檢測線，檢測WSSV的靈敏度有明顯的增加。出乎意料的是，加入單抗W28作為膠體金偶連物產生了相同的效果，因為酶聯免疫吸附測定和斑點雜交測試的結果都表明三種用在測試的WSSV單抗VP28（W1,W28和W30）都結合在VP28的非重疊抗原表位上。單抗W28引起干擾作用的原因現時還未清楚。但是，有可能的是單抗與膠體金顆粒（10nm）的結合導致了硬脂酸干擾了近端抗原表位的結合。為了解決此問題，只有單抗W1和W30分別被用在檢測線上和與膠體金的結合。圖6：PCR和RT-PCR檢測結果。在圖.3和圖.4被用來進行斑點雜交試驗的感染了WSSV和YHV的南美白對蝦游泳足勻漿分別用未感染的對蝦勻漿稀釋，并且用PCR檢測WSSV（A）和用RT-PCR檢測YHV（B）。M列：DNA marker；a列：10-3,b列：10-4，c列：10-5，d列：10-6，e列：10-7，f列：10-8，g列：未感染的對蝦游泳足勻漿。箭頭處：在最低稀釋度，633bp和135bp的PCR產物顯示出的可觀察到的陽性結果。即使雙重檢測試紙條中WSSV單抗W1使用最佳濃度（0.4mg/ml）比單一檢測WSSV試紙條使用抗體濃度（1.5mg/ml）要低，但是其對WSSV的檢測靈敏度卻高出100倍。此外，檢測線上的低濃度單抗W1令其檢測WSSV與遠離樣