1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上幾種不同類型顯微鏡的使用及其對胞質(zhì)環(huán)流的觀察一、實驗?zāi)康?學(xué)會使用相差顯微鏡，掌握暗視野技術(shù)，以及熒光顯微鏡等技術(shù)二、實驗原理 在活細(xì)胞中，原生質(zhì)流動是細(xì)胞活力強弱的重要標(biāo)志，它的產(chǎn)生與細(xì)胞中微絲的作用是密不可分的。微絲的纖維較細(xì)，直徑為56nm，主要成分是肌動蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一樣有收縮功能。微管是由一種叫做微管蛋白的蛋白質(zhì)組成的，位于原生質(zhì)（靜止的）外質(zhì)，緊靠在質(zhì)膜之下，離運動的內(nèi)質(zhì)至少有1µm的距離，與胞質(zhì)川流運動無關(guān)，主要起保持細(xì)胞形狀、承擔(dān)細(xì)胞運動和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)淖饔谩?另外，用秋水仙素與細(xì)胞松弛素B處理也可產(chǎn)生不同的結(jié)果。經(jīng)秋

2、水仙素處理后，細(xì)胞的纖維被擾亂，但不影響川流運動，這是與秋水仙素影響邊緣微管作用有關(guān)。相反，用細(xì)胞松弛素B處理，就可抑制細(xì)胞的川流運動，很明顯，微絲擔(dān)負(fù)著川流運動的功能。胞質(zhì)環(huán)流需要消耗能量，也受溫度、滲透壓以及離子濃度的影響。三、實驗材料 新鮮洋蔥鱗莖，剛毛藻等。四、實驗器材 相差顯微鏡，普通光學(xué)顯微鏡，黑卡紙，載玻璃片，蓋玻片，鑷子，吸水紙，剪刀，滴管，擦鏡紙。五、實驗藥品 100µg/ml秋水仙素溶液，20µg/ml細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B)，蒸餾水，香玻油，二甲苯。六、實驗步驟1. 取新鮮洋蔥鱗莖內(nèi)表皮約1cm2 或更小，放在干凈的載玻片上，加一小

3、滴水，將蓋玻片傾斜蓋上，并注意不出現(xiàn)氣泡，即制成水封片。2. 取一塊黑紙，把它剪成暗視野顯微鏡用的遮光板，并放入普通光學(xué)顯微鏡的聚光器下的光闌上，制成暗視野顯微鏡。（須反復(fù)調(diào)整遮光板的尺寸以得到最佳效果）。3. 把制成的水封片放在暗視野顯微鏡下用10倍物鏡觀察，可以看到在明亮的細(xì)胞壁與半透明的細(xì)胞核之間有很多極小而明亮的“質(zhì)點”或顆粒，仔細(xì)觀察，可以看出這些正作有向的運動（速度很慢），水封片中多加些水會促進這種運動。4. 學(xué)習(xí)相差顯微鏡，熒光顯微鏡和倒置顯微鏡的使用方法和有關(guān)操作技術(shù)。植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一、實驗?zāi)康?掌握細(xì)胞染色的基本過程及非切片法制片技術(shù)，了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，學(xué)會制

4、作永久封片。二、實驗原理 當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX100處理細(xì)胞時，因其非離子型表面活性劑的特性，可以除去可溶性蛋白質(zhì)和脂類，而微絲束屬不可溶性蛋白，就不會被TritonX100破壞而保留在細(xì)胞中。當(dāng)用考馬斯亮藍R250染色時，在光學(xué)顯微鏡下通常能觀察到以核為中心的纖維狀骨架，在質(zhì)膜下還能見到絲狀骨架，骨架上常附著一些與膜運動、整合有關(guān)的蛋白質(zhì)。 考馬斯亮藍R250并不是特異地顯示微絲，但由于有些細(xì)胞骨架纖維如微管等在該實驗條件下不夠穩(wěn)定，又因有些類型的纖維太細(xì)而在光學(xué)顯微鏡下無法分辨，因此看到的是由微絲組成的纖維束，直徑約在40nm左右。 三、實驗材料 新鮮洋蔥鱗狀葉。四、實驗器材 普通

5、光學(xué)顯微鏡，50ml燒杯，滴管，試劑瓶，載玻片，蓋玻片，鑷子，染色板，吸水紙，擦鏡紙。 五、實驗藥品 1M緩沖液：所含各成分終濃度為50mmolL瞇唑，50mmolLKCL，0.5mmolLMgCl2，lmmolLEGTA(乙二醇雙(氨基乙基醚四乙酸)，0.1mmolL EDTA，lmmolL巰基乙醇或二硫蘇糖醇<DTT)。lmolL HCl調(diào)pH到6.8 2 0.01mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8) 用0.2mol/L磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液稀釋配制 其中磷酸鹽緩沖液配法：0.2mol/LNa2HPO4 49ml 0.2mol/LNaH2PO4 5lml3. 1TrltonX1

6、00，用M緩沖液配制。 40.2考馬斯亮藍R250。配制用的溶劑為：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。 · 5. 3戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)配制 6. 50，70，95乙醇。 7. 叔丁醇 8. 正丁醇 9. 二甲苯。 10.中性樹膠。六、實驗步驟 1. 撕取洋蔥鱗狀葉內(nèi)表皮約lcm大小，取若干片，置于裝有pH6.8磷酸鹽緩沖液的50ml燒杯中，用鑷子輕按入使其浸沒5min。 2吸去磷酸鹽緩沖液，用lTritonX100處理2030min。 3. 吸去TrironXi00液，用M-緩沖液洗3次，每次10min左右。 4. 用3戊二醛固定0.

7、5h。 5. 再用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10min。 6. 0.2考馬斯亮藍R250染色2030min（在染色板上）。 7. 用蒸餾水洗12次，將樣品置于載玻片上，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，先低倍，再高倍，最后用油鏡。 8. 如觀察結(jié)果較佳，可制作永久封片：在有樣品的50ml燒杯中，依次用如下試劑處理:50乙醇，70乙醇，95乙醇，(1/2)V 95乙醇+(1/2)V叔丁醇，叔丁醇(以上每個步驟反應(yīng)510min)或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯(每個步驟510min)。然后，將樣品置于載玻片上展開，鏡檢后滴一滴中性樹脂，蓋上蓋玻片。葉綠體的分離與熒光觀察一、 實驗?zāi)康恼莆帐止ぶ谱髅芏忍荻燃夹g(shù)，

8、了解蔗糖密度梯度離心的原理及優(yōu)缺點。二、 實驗原理用兩種濃度的蔗糖溶液制成的梯度，在離心條件下，葉綠體和比它 沉降系數(shù)小的細(xì)胞組分聚集到梯度交界處，而沉降系數(shù)較大的細(xì)胞組 分沉到離心管底部，這樣，可粗略地分離葉綠體。三、 實驗材料新鮮菠菜葉四、 實驗器材組織搗碎器，高速冷凍離心機，普通離心機，離心管，Corex離心 管，燒杯，漏斗，紗布，載玻片，蓋玻片，普通光學(xué)顯微鏡，剪刀，滴管，熒光顯微鏡。 五、實驗藥品 勻漿介質(zhì)(0.25molL蔗糖、0.05molL TrisHCi緩沖液，pH7.4)：稱取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸餾水中，加入約425ml0.lmolLH

9、CI，最后蒸餾水定容至1000ml。 50蔗糖溶液，15蔗糖溶液。0.35M氯化鈉，0.01吖啶橙六、實驗步驟(一)葉綠體的密度離心 l. 洗凈菠菜葉，盡可能使它干燥，去除葉柄、主脈后，稱取5g，剪碎。 2. 加入預(yù)冷到近0'C的勻漿介質(zhì)10ml，在研缽內(nèi)低溫?fù)v碎o。 3搗碎液用雙層紗布過濾到燒杯中。 4. 濾液移入普通玻璃離心管，在普通離心機上1000rmin離心1min。 5. 在2ml離心管內(nèi)依次加入50蔗糖溶液和15蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15蔗糖液沿離心管壁緩緩注入，不能攪動50蔗糖液面，50蔗糖溶液加0.9ml，15蔗糖溶液加0.5ml。加液完后，可見兩種溶液界面處折光稍

10、有不同，這樣密度梯度就制好了。 6在制好的密度梯度上小心地沿離心管壁加入0.3ml上清液。 7離心8000rmin，20min。 8. 取出離心管，可見葉綠體在密度梯度液中間形成帶；用滴管輕輕吸出滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。還可在暗室內(nèi)用熒光顯微鏡觀察。 (二)菠菜葉手切片觀察 用剃須刀將新鮮的嫩菠菜葉切削一斜面置于載片上，滴加12滴0.35molLNaCl溶液，加蓋片后輕壓，置顯微鏡下觀察，(1) 在普通光鏡下觀察· (2)在熒光顯微鏡下觀察 (3)用同樣方法制片，但滴加12滴0.01吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。七、實驗結(jié)果 (一)

11、葉綠體的分離和觀察 1. 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。 2. 以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例，在選用Bblue激發(fā)濾片、B 雙向色鏡和0-530阻斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。 3. 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。 （二）菠菜葉手切片觀察 1在普通光鏡下可以看到三種細(xì)胞 ， (1)表皮細(xì)胞：為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細(xì)胞。 (2)保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細(xì)胞。 (3)葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長形和橢園形細(xì)胞。 葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下帶可以看到綠色的基粒。 2在熒光顯

12、微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體側(cè)環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。 3用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā) 綠色熒光，氣孔仍為綠色。細(xì)胞組分的分離一、實驗?zāi)康?掌握分級分離方法。二、實驗原理 利用細(xì)胞內(nèi)各組分在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取分級差速離心的方法，將各組分逐級分離出來。三、實驗材料 小鼠(30克)取肝臟四、實驗器材 同實驗七 外加eppendorf管、微量進樣器、tip頭、臺式高速冷凍離心機。五、實驗藥品 勻漿介質(zhì)(0.25mol/L蔗糖OOlmol/LTris-鹽酸緩沖

13、液 pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理鹽水，姬姆薩染液，中性紅一 詹納斯綠染液(稱取0.04g中性紅、0.02g詹姆斯綠溶于l00ml， 0.25mol/L蔗糖溶液中)。 其中0.01mo/LTris鹽酸緩沖液配法：0.lmol/L三羥甲基氨 基甲烷(Tris)10ml， 0.1mol/L鹽酸8.4ml加蒸餾水至100ml。六、實驗步驟 1.低速離心分離細(xì)胞核(1)將饑餓24小時的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪開腹部，迅 速取出肝組織浸入預(yù)冷的生理鹽水中洗去血污，用濾紙吸干。， (2)稱取0.5g肝組織，放在小燒杯中剪碎，用少量預(yù)冷的勻漿介質(zhì)洗滌數(shù)次。 (3)將燒杯內(nèi)懸浮組織倒入玻璃

14、勻漿器中進行冰浴勻漿。用4層 紗布(先用少量勻漿介質(zhì)濕潤)過濾勻漿液至Corex離心管中，同時制備l張濾液涂片，做好標(biāo)記，自然干燥。 (4漓心機上500rmin離心5min(4)，將上層溶液吸入2支eppendof管中，蓋緊蓋子放在有冰塊的器皿內(nèi)，待分離線粒體時用。沉淀物作進一步處理。 (5)用5ml勻漿介質(zhì)懸浮離心下的沉淀物，用吸管混勻，以1000rmin離心10min(4)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀物上層涂片。剩余的沉淀物加入0.3-0.5ml勻漿介質(zhì)，用吸管吹打成懸液，再制備一張涂片做好標(biāo)記， 自然干燥。 2. 高速離心分離線粒體 (1)將步驟l(4)中的eppendof管在臺式高

15、速冷凍離心機上以10000rmin離心5min，緩緩吸出上清液至另2 eppendorf管，留取沉淀物冰浴保存，待涂片鑒定。 (2) 另2支上清液在臺式高速冷凍離心機上以13000rmin離心5min。 (3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鑒定時用。 3分離物的鑒定 (1)細(xì)胞核。將步驟l中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定15min，吹干，滴姬姆薩染液(原液用115mol磷酸緩沖液稀釋1020倍)染色10min，自來水沖洗，吹干，在高倍鏡下比較觀察涂片。 (2)線粒體。在2張干凈載玻片中央各滴23滴中性紅詹納斯綠染液，取步驟2高速離心得到兩份沉淀物分別均勻地涂布在玻片上，染色30min后分

16、別蓋上蓋玻片，在高倍鏡下觀察。附：更精致的分離方案 將4.5ml0.34molL蔗糖溶液放入離心管，然后沿壁小心地加入4.5ml鼠肝勻漿使覆蓋于上層。用高速冷凍離心機以700×g離心10min，得上清液I和沉淀物。沉淀物用10ml 0.25molL蔗糖溶液洗2次，每次1000×g離心10min，得到的沉淀物可進行以下處理。(1)收集質(zhì)膜：吸出沉淀中較疏松的上層，混懸于比重為1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心加入已放在離心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上層，經(jīng)700×g離心10min，質(zhì)膜最終集中在兩溶液界面上，吸出質(zhì)膜層。（2）細(xì)胞核純化：將沉淀用5倍體積的0.34

17、molL蔗糖0.5molLMg(Ac)2溶液混懸，鋪在4倍于核懸液體積的0.88m01'L蔗糖0.5molLMg(Ac)2溶液之上，1500×g離心20min，沉淀物即為純化的細(xì)胞核。（3）分離核仁：純化的細(xì)胞核混懸在2倍體積的0.34molL蔗糖0.5molLMg(Ac)2溶液中，超聲波破核膜，釋放出核仁，注意蔗糖介質(zhì)pH中性或弱堿性時核膜才易破碎，超聲后的懸液鋪于4倍體積的0.88molL蔗糖0.5moILMg(Ac)2溶液之上，1700×g離心17min。沉淀物即為核仁，溶液為上清液I。 將上清液I 10000×g離心lOmin得上清液和沉淀物，沉淀

18、物以lOml預(yù)冷的0.25molL蔗糖溶液洗2次，每次10000×g離心10min，得沉淀物即為純化的線粒體。 上清液經(jīng)16 300×g離心20min得上清液和沉淀物，沉淀物以lOml預(yù)冷的0.25m01L蔗糖溶液洗；16300×g離心20min，得沉淀物即為純化的溶酶體。 上清液經(jīng)100 000Xg離'30min，得沉淀物(為微粒體)和上清液，后者再經(jīng)離心×g 3h左右可獲得核糖體、病毒、生物大分子等。四膜蟲纖毛的再生一、背景和原理纖毛和鞭毛是細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)，具有運動功能。纖毛和鞭毛的結(jié)構(gòu)基本相同。纖毛軸心含有一束“92”排列的平行微管，中

19、央微管均為完全微管，外圍二聯(lián)體微管由A，B亞纖維組成，A亞纖維為完全微管，由13個球形亞基環(huán)繞而成，B亞纖維僅由10個亞基構(gòu)成，另3個亞基與A亞纖維共用(圖9-16)。微管是由微管蛋白組成的管狀結(jié)構(gòu)，對低溫、高壓和秋水仙素敏感。大多數(shù)微管纖維處于動態(tài)的組裝和去組裝狀態(tài)，這是實現(xiàn)其功能所必需的過程。本實驗以Rosenbaum和Carlson（1969）的實驗為基礎(chǔ)，在降低pH和鈣離子存在的條件下通過機械修剪的方法，在膜水平脫去四膜蟲的纖毛，剩下腫脹的，不能運動的細(xì)胞。在不同的生長溫度（25和17）下觀察纖毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微管亞單位的合成和組裝。二、實驗?zāi)康?使用相差顯微

20、鏡和血球計數(shù)器；2了解微管組裝的基本原理三、教學(xué)安排學(xué)時數(shù)：34小時。四、實驗儀器、器材與試劑1材料：梨形四膜蟲。2儀器：錐形瓶，相差顯微鏡，血細(xì)胞計數(shù)器，臺式離心機，滴管，注射器，parafilm膜，載玻片，蓋玻片，定時器。3試劑：蛋白胨，亞胺環(huán)己酮，新霉素，秋水仙堿，EDTA，醋酸鈉，氯化鈣。五、實驗方法與步驟1、 分別將250毫升含1%蛋白胨四膜蟲培養(yǎng)物置于500毫升錐形瓶中于25和17培養(yǎng)。（時間）2、 兩瓶培養(yǎng)物分別800g離心10分鐘，重新懸浮于15毫升1%蛋白胨溶液，置于50毫升錐形瓶，做好標(biāo)記。3、 準(zhǔn)備2個50毫升錐形瓶，各加入15毫升1%蛋白胨溶液；3個100毫升錐形瓶，含

21、20毫升1%蛋白胨溶液，分別加入10微克/升亞胺環(huán)己酮；50微克/升亞新霉素；加入2毫克/升秋水仙堿。4、 以下操作在冰浴上進行：1） 在零時間，用一個大試管在冰浴上將2.5毫升濃縮的四膜蟲懸液（生長于25）加至5毫升介質(zhì)A（10mMEDTA·2Na; 50mM醋酸鈉；pH6.0）中，攪拌混勻。2） 30秒后加入2.5毫升預(yù)冷的蒸餾水。3） 1分鐘后加入0.25毫升預(yù)冷的0.2McaCl2, parafilm膜封口，倒轉(zhuǎn)試管使之混合。4） 2分鐘后用裝有19號針頭的注射器吸取懸液并注入預(yù)冷的試管中（修剪掉四膜蟲的纖毛）。迅速用滴灌取少量懸液，滴加在載玻片上鏡檢，觀察其是否失去運動性。

22、5） 去纖毛后，立即把1毫升去纖毛的細(xì)胞加至20毫升1%蛋白胨溶液，25預(yù)熱的100毫升錐形瓶中，于25培養(yǎng)并開始實驗。5、 每隔10分鐘取出定量的樣品，對其隨時間變化的能動性（motility）%進行分析。由于脫纖毛的細(xì)胞不能運動，切記在取樣前振蕩錐形瓶。在血細(xì)胞計數(shù)器上觀察，估計運動細(xì)胞和非運動細(xì)胞的數(shù)目。制備快速標(biāo)本，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞是否腫脹，有無新生纖毛等情況。6、 同時對生長于17的四膜蟲進行脫纖毛，并同在25的四膜蟲的纖毛再生時間比較。7、 從生長于25的四膜蟲懸液制備新鮮脫纖毛的細(xì)胞，在分別加入亞胺環(huán)己酮，新霉素，秋水仙堿和空白對照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升錐形

23、瓶中各加入1毫升脫纖毛細(xì)胞。每隔10分鐘分別從瓶中取樣，觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。 8、 從生長于17的四膜蟲懸液制備新鮮脫纖毛的細(xì)胞，在分別加入亞胺環(huán)己酮，新霉素，秋水仙堿和空白對照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升錐形瓶中各加入1毫升脫纖毛細(xì)胞。每隔10分鐘分別從瓶中取樣，觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。 9、 從生長于25的濃縮四膜蟲懸液制備一些新鮮的脫纖毛細(xì)胞。對下列各個瓶中分別加入1ml脫纖毛細(xì)胞： （i）蛋白胨10µg/ml亞胺環(huán)己酮（ii）蛋白胨50µg/ml新霉素（iii）蛋白胨2mg/ml秋水仙堿（iv）只含蛋白胨作為對照每隔10分鐘從瓶中取樣。讓實驗進行盡可能

24、長的時間，以便觀察其反應(yīng)是否發(fā)生改變。記錄結(jié)果實驗結(jié)果以能動性（）對時間（min）作圖表示：（1）生長于25和17的四膜蟲；（2）抑制物對纖毛再生的效應(yīng)。討論作為這一實驗的引伸，還可以應(yīng)用更多的抑制物來表明，是否需要生成新的信息性分子，細(xì)胞周期中的不同時相是否起重要作用？對抑制物的觀察可以時可逆的，因為經(jīng)過一個時間階段后，細(xì)胞可以克服由于秋水仙堿引起的組裝阻斷。這些實驗著眼于纖毛的再生系統(tǒng)，在這些系統(tǒng)中很容易辨認(rèn)出重點。這些實驗還為諸如纖毛和鞭毛等微管結(jié)構(gòu)的合成和組裝提供資料。六、實驗提示與注意事項1.梨形四膜蟲的純培養(yǎng)可培養(yǎng)于1蛋白胨（1蛋白胨；0.25酵母浸膏），培養(yǎng)液用15磅/時2高壓滅

25、菌15分鐘。在接種培養(yǎng)物和整個培養(yǎng)過程中需用無菌技術(shù)，但在課堂實驗時無需應(yīng)用無菌采樣技術(shù)。為了獲得實驗所需數(shù)量的培養(yǎng)物，含250ml蛋白胨的500ml錐形瓶在25可培養(yǎng)12天，而在17需23天。這一體積的培養(yǎng)物可用來接種25瓶新的250ml培養(yǎng)物。2生長的溫度很重要；如果四膜蟲沒有在25生長至少6天的話，則再生速率顯著延緩。因此，對兩種不同生長溫度的比較，形成了本實驗中一部分的基礎(chǔ)。 3.四膜蟲的離心必須小心，因為在減速時細(xì)胞容易被漩渦卷起。如果參加實驗的學(xué)生較多，或沒有經(jīng)驗，最好在實驗時由一位技術(shù)員來離心細(xì)胞。通常800g即可，但也可用1000g。七、思考題纖毛再生所需的時間，是包括微管蛋白

26、的合成和組裝在內(nèi)的許多過程決定的。培養(yǎng)物原先生長的溫度為什么能影響纖毛再生率？通過抑制物的實驗結(jié)果，我們能否確定在實驗過程中，纖毛再生取決于現(xiàn)存前體庫的大小和新蛋白質(zhì)合成的程度？在較低級的真核細(xì)胞中我們能學(xué)到什么有關(guān)蛋白質(zhì)合成的知識？八、推薦閱讀Rosenbaum,J.L.and Carlson,K. 1968 Cilia Regeneration in Tetrahymena and its Inhibition by Colchicine ,J.cell Biol.,40,415Rosenbaum,J.L.and Child,F.M 1967Flagellar Regeneration i

27、n Protozoan Flagellates ,J.Cell Biol.,34,345Rosenbaum,J.L., Moulder, J.E. and Ringo,D.L. 1969 Flagellar Elongation and Shortening in Chlamydomonas,J.Cell Biol,41,600植物愈傷組織誘發(fā)培養(yǎng)一、實驗?zāi)康?掌握無菌操作進行愈傷組織誘發(fā)培養(yǎng)的方法。二、實驗原理 植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)是進行植物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)工作。一般認(rèn)為，分化了的植物根、莖、葉細(xì)胞具有全能性，在一定條件下進行離體培養(yǎng)，給予合適的營養(yǎng)條件和激素水平，可以脫分化為愈傷組織。利用

28、愈傷組織可以進行一些生物化學(xué)、發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究工作，例如愈傷組織能進一步誘導(dǎo)分化成完整的植株，還可以將愈傷組織進行單細(xì)胞分離，做懸浮培養(yǎng)，篩選各種生化突變型。三、實驗材料 煙草或迎春花莖段 四、實驗器材 培養(yǎng)皿，燒杯，鑷子，剪刀，小三角燒瓶，大三角燒瓶，酒精燈，酒精棉花，滴管，試劑瓶，濾紙，錫箔紙，超凈工作臺，植物細(xì)胞培養(yǎng)室。五：實驗藥品 MS固體培養(yǎng)基(見附錄，加08%瓊脂)：培養(yǎng)基中加生長素2.4D，為脫分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加細(xì)胞分裂素6一BA和生長素NAA，為分化培養(yǎng)基，和其它成分相同。 70乙醇，漂白粉溶液(1片漂白粉片加300ml水)，無菌水。六：實驗步驟 1培養(yǎng)基的配制：

29、MS固體培養(yǎng)基滅菌后稍冷，倒入無菌 培養(yǎng)皿分裝，或者直接配在三角瓶中，瓶口用二層牛皮 紙蓋上用繩扎緊，滅菌后待用。 2迎春花枝條，去葉，用水洗莖。洗干凈后剪取5cm長的 枝條3段，投入70%乙醇中浸泡30秒。再轉(zhuǎn)入漂白粉 溶液，消毒lmin。 3移入超凈臺，按無菌操作要求將莖段取出置于無菌培養(yǎng) 皿內(nèi)，用無菌水反復(fù)沖洗。再用無菌鑷子移入另一培養(yǎng) 皿內(nèi)，再用無菌水反復(fù)沖洗。 4將莖段剪小，每段約lcm長，放入脫分化培養(yǎng)基，每皿 67段，均勻分散在培養(yǎng)皿中，26暗培養(yǎng)34天，觀 察有無染菌。 5挑取無污染莖段，轉(zhuǎn)接入新的脫分化培養(yǎng)基，繼續(xù)暗培 養(yǎng)7天，可觀察到愈傷組織開始生長。 6如果以無菌煙草為材

30、料，可跳過2、3兩步，省去消毒、 漂洗過程。直接進入第5步。取煙草葉片進培養(yǎng)。 培養(yǎng)7天檢查有無染菌，如有污染再轉(zhuǎn)接一次，繼續(xù) 暗培養(yǎng)7天，在這階段可以看到葉片細(xì)胞脫分化產(chǎn)生愈 傷組織。 7將煙草愈傷組織轉(zhuǎn)接到細(xì)胞分化培養(yǎng)基，照光培養(yǎng)2 3周，可以觀察到細(xì)胞分化產(chǎn)生新的苗。鼠腎細(xì)胞原代培養(yǎng) 一、實驗?zāi)康?了解細(xì)胞原代培養(yǎng)的原理和方法，學(xué)習(xí)細(xì)胞消化、細(xì)胞計 數(shù)、營養(yǎng)液的配制等操作技術(shù)，觀察原代細(xì)胞的形態(tài)。 二、實驗原理 原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的器官組織，經(jīng)消化，培養(yǎng)成為單個細(xì)胞的過程。用胰蛋白酶對組織進行消化獲得單細(xì)胞懸液，由細(xì)胞懸液定量接種后獲得原代細(xì)胞培養(yǎng)物。胰蛋白酶的作用是消化

31、除去細(xì)胞間質(zhì)，蛋白酶液中可添加膠原酶以增加消化能力。 細(xì)胞培養(yǎng)是探索細(xì)胞生命活動規(guī)律一種基本的、十分有效的實驗技術(shù)，通過細(xì)胞培養(yǎng)可以進行細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的生長發(fā)育等等各項研究，目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。 三、實驗材料 出生后一周左右的乳鼠。四、實驗器材 細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心機，超凈工作臺。細(xì)胞培養(yǎng)皿，滴管，血球計數(shù)板，吸液器，眼科剪刀，鑷子，小離心管。五、實驗藥品 RPMl640培養(yǎng)液，小牛血清，青霉素，鏈霉素，025胰蛋白酶和01膠原酶，75乙醇，碘酒，乙醚，PBS，EDTA。六，實驗步驟：1. 按無菌操作技術(shù)，消毒超凈工作臺及雙手。2. 用乙醚麻醉法處死小鼠：將乙醚棉球放進燒杯中，

32、然后放入小鼠， 蓋住杯口片刻等小鼠死亡。3. 碘酒消毒腹部皮膚。4. 75酒精脫碘2次，然后進入超凈工作臺操作。5. 用酒精消毒雙手及臺面。6. 用第一副眼科鑷及眼科剪“工”字型剪開皮膚。7. 用第二副眼科剪，剪開拉開腹膜。8推開腸管，在腹后壁找到腎臟，并剪取全腎。將剪刀放入75 酒精中浸泡，待用。9. 置腎臟于滅菌的盛有PBS滅菌液的培養(yǎng)皿。（直徑60mm）中洗 兩次。夾取腎組織，移至滅菌1.5ml離心管內(nèi)，將剪刀在無菌PBS 中洗一下，剪碎腎組織，越碎效果越好。10. 加入025胰蛋白酶+1膠原酶lml，混合均勻。11. 37作用15分鐘，每五分鐘輕輕彈擊。12. 無菌滴管輕輕吹打已消化組

33、織20次，注意避免液體外溢。13. 1000RPM，離心1分鐘，沉淀未消化的組織塊和殘渣。14. 吸取含有離散細(xì)胞的上清液至另一個管內(nèi)。15. 3000RPM離心2分鐘，收集離散細(xì)胞。16棄去上清液，加入完全培養(yǎng)液lml，吹打均勻。17吸取l0µl，加入細(xì)胞計數(shù)板中，進行細(xì)胞計數(shù)。要求數(shù)四個角 的16個小格中細(xì)胞數(shù)的總和。然后按照以下公式計算細(xì)胞密 度。總計數(shù)結(jié)果 *1000*稀釋倍數(shù)=細(xì)胞個數(shù)/mL4 18. 按105細(xì)胞/ml，吸取lml細(xì)胞加lml培養(yǎng)液，接種到35mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中。19. 輕輕混勻細(xì)胞，置培養(yǎng)皿于37，5的C02培養(yǎng)箱中，第二天 觀察，換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，第

34、四天觀察結(jié)果。哺乳動物貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一、實驗?zāi)康?了解哺乳類動物離體貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)條件；掌握貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代技術(shù)；觀察傳代細(xì)胞貼壁、生長和繁殖過程中細(xì)胞形態(tài)變化和形成單層；掌握細(xì)胞培養(yǎng)中一些常用培養(yǎng)基、緩沖液、消化液、抗生素、完全培養(yǎng)液的配制方法及各種無菌消毒方法；掌握細(xì)胞計數(shù)方法。二、實驗原理 要使細(xì)胞能在離體條件下存活并代代相傳，必須在體外人工模擬個類似于體內(nèi)的環(huán)境。所要求的這個環(huán)境呈液態(tài)，它包含有細(xì)胞賴以生存的基本培養(yǎng)基、一定的滲透壓和氫離子濃度(即pH)，要有足夠的空間，能在恒溫恒壓和無菌的條件下以滿足細(xì)胞群體增殖和代謝的需要。離體貼壁培養(yǎng)細(xì)胞當(dāng)群體增殖匯合形成單層細(xì)胞群體達到飽

35、和密度時，必須進行傳代。傳代過程是通過胰蛋白酶消化將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶（皿）上脫落并分散成單細(xì)胞，經(jīng)過稀釋(或不經(jīng)稀釋)從一個容器上轉(zhuǎn) 移到另一個容器并給予新鮮培養(yǎng)液進行再培養(yǎng)。這種傳代過程稱為傳代培養(yǎng)。三、實驗材料 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞株（系）、CH0、Hela、L929、或其他細(xì)胞1-2瓶。四、實驗器材 設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱，電熱恒溫干燥箱，高壓消毒鍋，水浴鍋，離心機，冰箱，無菌室或超凈工作臺。器具：培養(yǎng)瓶(皿)36只，離心管2只，試管2只，滴管，5ml、10ml，移液管各若干支，血球計數(shù)板1塊，污物缸，橡皮塞，吸液器，pH試紙，消毒藥棉等高壓或高溫滅菌備用。 五、實驗藥品 RPMl1640培養(yǎng)基，5NaH

36、CO3，小牛血清，青霉素，鏈霉素，谷氨酰胺，0.25胰蛋白酶液，0.1EDTA-Na2液，75乙醇，HCl，臺酚藍染色液，NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2P04。六、實驗步驟 l. 洗凈雙手，入無菌室緩沖間穿戴工作服、鞋、帽、口罩后進入無菌室。 2點燃煤氣(或酒精)燈，用75乙醇棉球抹拭雙手、操作臺表面、各種試劑瓶口。 3. 配制有關(guān)溶液 （1）RPMll640培養(yǎng)液： 1640粉劑一袋(10.4g)1升millce水谷氨酰胺0.3g+NaHCO32g，混勻后逐滴加入0.5ml濃HCI到pH6.8，過濾滅菌，分裝，-20保存。臨用時加10小牛血清和兩種抗菌素溶液；最終濃度分別為100單

37、位毫升。 （2）小牛血清滅活：小牛血清溶解后放置56，30min，然后分裝小瓶，-20保存。 （3）兩種抗菌素(雙抗)溶液：取青霉素80萬單位和鏈霉素80萬單位，溶于80ml無菌水中，配成每毫升1萬單位溶液，4保存。 （4） PBS溶液：NaCl 4g， KCl 0.lg，Na2HPO4(無水)0.57g或(12H2O)1.43g，KH2PO4 0.lg,雙蒸水500mlpH7.2，10磅20分鐘滅菌，4保存。 （5）0.1EDTA：l00mg EDTA100ml PBS （6）胰蛋白酶溶液：50mg胰蛋白酶l00mlPBS （7）胰酶消化液：溶液(5)+(6)，得到200ml溶液過濾滅 菌。

38、 （8）細(xì)胞培養(yǎng)液：45ml 1640培養(yǎng)液5ml小牛血清+0.5m1雙 抗。4 消化細(xì)胞 取接種35天形成單層的細(xì)胞株，使細(xì)胞面朝上，將培養(yǎng)液用吸管吸去，用12滴管PBS洗12次，加入2滴管消化液。消化12min，待細(xì)胞單層上出現(xiàn)透明針尖小孔隙時（此時鏡檢可見成片層的細(xì)胞固縮成圓形，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸松散或互不接觸)，使細(xì)胞面朝上，輕輕吸去消化液，丟入廢物缸，然后加入2滴管完 全培養(yǎng)液，吸打細(xì)胞使其成細(xì)胞懸液。如果消化過頭而細(xì)胞已自行脫落時，可加少量血清或完全培養(yǎng)液 以中止消化。滴管吸打均勻使成細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至離心管離心(1000r ，35min后用完全培養(yǎng)液再懸浮。 5. 細(xì)胞接種 取

39、小型細(xì)胞培養(yǎng)瓶1只，然后加入5ml左右培養(yǎng)液，再將上述細(xì)胞懸液等量（1：3或1：4）或不等量（根據(jù)實驗需要）接種入內(nèi)，打勻、平置、編號，37培養(yǎng)，隔天觀察結(jié)果。6. 細(xì)胞計數(shù) 胰酶徹底消化細(xì)胞，用4.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到試管中，加0.5ml臺酚藍染色液，滴管吸打細(xì)胞懸液使均勻，吸取細(xì)胞懸液（要充滿滴管，不能有氣泡）沿細(xì)胞計數(shù)板血蓋片邊沿輕輕滴入計數(shù)板（不能有氣泡、空隙，也不能使其外溢以免定量有誤），在光學(xué)顯微鏡(10Xl0)下計數(shù)按圖中四角大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，按公式計算如下 4大格細(xì)胞總數(shù)*104 4求出每ml平均細(xì)胞數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)為該瓶細(xì)胞總數(shù)。 附錄二 細(xì)胞培養(yǎng)用液 - 1.

40、平衡鹽液 （1）Hank液原液：取NaCl 80.0g，Na2HPO4·2H2O 0.6g，KCl 4.0g，KH2PO4 0.6g，MgSO4·7H2O 2.0g，葡萄糖10.0g，無水CaCl2 1.4g， 加水至1000ml。配制：取Hank原液100ml，加蒸餾水896ml，加0.5酚紅4ml，混 勻。分裝，包扎，0.0552MPa(8psi)/30min或-.0689MPa臨用前，加NaHCO3液調(diào)pH至7.2。（2）D-Hank液NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO4·12H2O 0.12g，KH2PO4 0.06g，葡萄糖 1.0g，酚紅（1）2ml，加三蒸水至1000ml。0.0689MPa（10psi）/10min滅菌，冷卻后置4冰箱保存。（3）Earle液原液A：取NaCl 68.Og，KCl 4.0g，NaH2PO4·H2O 1.4g，葡萄糖 10.0g，加水至500ml。原液B:取CaCl2 2.0g，MgSO4·7H2O 2.0g，0.5%酚紅4.0ml，加 水至500ml。