1、北京理工大學(xué)珠海學(xué)院2016屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 貝伐珠單抗原液生產(chǎn)車間工藝設(shè)計(jì)貝伐珠單抗原液生產(chǎn)車間工藝設(shè)計(jì)摘 要貝伐珠單抗是一種抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的人源化的單克隆抗體，廣泛適用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和晚期、轉(zhuǎn)移性肺癌等多種腫瘤的治療。現(xiàn)如今不斷對(duì)貝伐珠蛋白藥物以及更多適應(yīng)癥的深入研究，貝伐珠單抗將成為重要的抗腫瘤血管生成藥物，其蛋白藥物將需要大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)滿足市場(chǎng)需求。本論文通過(guò)查閱貝伐珠單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，利用分批補(bǔ)料方法對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并對(duì)貝伐單抗原液生產(chǎn)進(jìn)行車間設(shè)計(jì)。本設(shè)計(jì)主要為發(fā)酵和純化車間的設(shè)計(jì)，包括物料衡算、熱量衡算、廠房設(shè)計(jì)及設(shè)備選型等。關(guān)鍵詞：貝伐珠單抗;生產(chǎn)工藝;

2、物料衡算；廠房設(shè)計(jì)PROCESS DESIGN OF BEVACIZUMAB RAW SOLUTION PRODUCTION WORKSHOPAbstractBevacizumab is a humanized monoclonal antibody that inhibits vascular endothelial growth factor. It is widely used in the treatment of metastatic colorectal cancer, advanced and metastatic lung cancer and other tumors. No

3、wadays, bevacizumab will become an important anti-tumor angiogenic drug due to the continuous in-depth research on bevacizumab and more indications, and its protein drug will need large-scale industrial production to meet the market demand. In this paper, the production process of bevacizumab was re

4、viewed, and the CHO cells were fermented and cultured with batch feeding method, and the production workshop of bevacizumab was designed. This design mainly for fermentation and purification workshop design, including material balance, heat balance, plant design and equipment selection.Keywords: bev

5、acizumab；production process；material balance；plant designII目 錄1前言11.1簡(jiǎn)介11.2貝伐珠單抗在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用11.2.1 結(jié)直腸癌11.2.2卵巢癌11.2.3 胃癌21.2.4 非小細(xì)胞肺癌21.2.5其他腫瘤21.3用藥不良反應(yīng)21.4 貝伐珠的發(fā)展概況31.5展望42貝伐珠單抗工藝流程設(shè)計(jì)52.1生產(chǎn)工藝流程52.2生產(chǎn)工藝流程說(shuō)明62.2.1藥物原液（DS）62.2.2藥物制劑（DP）113工藝計(jì)算133.1生產(chǎn)周期133.2貝伐珠單抗原液基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及工藝指標(biāo)133.3貝伐單抗原液車間的物料衡算144熱量平衡計(jì)算17

6、4.1熱平衡方程174.2發(fā)酵工序熱量衡算174.2.1發(fā)酵罐空消蒸汽用量174.2.2種子罐空消蒸汽用量185水平衡計(jì)算206氧氣物料平衡217主要大型設(shè)備選型227.1發(fā)酵罐及種子罐的選擇227.2其他設(shè)備主要參數(shù)228總結(jié)26參考文獻(xiàn)27謝 辭28附錄291前言1.1簡(jiǎn)介貝伐珠單抗注射液是用于抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的一種人源化的單克隆抗體，用于聯(lián)合化療作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、晚期非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的一線治療方案1,2。貝伐珠單抗的藥理作用與機(jī)制：貝伐單抗可以通過(guò)選擇性地與人體內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）細(xì)胞相結(jié)合作用來(lái)有效減弱或阻止生長(zhǎng)因子與VEGF細(xì)胞受體的相互結(jié)合

7、，起到幫助腫瘤化療藥物更好地直接到達(dá)腫瘤內(nèi)部或細(xì)胞間,最終有效地抑制了腫瘤內(nèi)部血管的新生和細(xì)胞再生,從而充分發(fā)揮化療持續(xù)抑制腫瘤血管生長(zhǎng)的重要的作用3。貝伐珠單抗特點(diǎn)：1、 廣譜：貝伐珠單抗在新生腫瘤血管生成具有針對(duì)性抑制能力2、 半衰期長(zhǎng):貝伐單抗相比較其他藥物下半衰期較長(zhǎng)，大約20d3、 無(wú)交叉耐藥:不受細(xì)胞毒性藥物耐藥性影響1.2貝伐珠單抗在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用1.2.1 結(jié)直腸癌據(jù)2012年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析4顯示結(jié)直腸癌在全國(guó)發(fā)病率、死亡率分別排第、位。雖然結(jié)直腸癌可以通過(guò)手術(shù)切除，仍有20%-30%患者手術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況。加上國(guó)內(nèi)暫無(wú)全國(guó)性的結(jié)直腸癌篩查方案，導(dǎo)致大部分

8、結(jié)直腸癌患者在就診時(shí)己經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移5。與以往的化療和放療為主治療手段相比，貝伐珠單抗的出現(xiàn)與使用，在一線治療方案中聯(lián)合基礎(chǔ)化療貝伐珠單抗顯著延長(zhǎng)患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期，并在二線治療、維持治療中，貝伐珠單抗均能給患者產(chǎn)生顯著療效。1.2.2卵巢癌隨著若干項(xiàng)大型期臨床研究數(shù)據(jù)證實(shí)在標(biāo)準(zhǔn)化療方案的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用貝伐珠單抗，不但能夠提高患者的臨床緩解率，延長(zhǎng)生存時(shí)間，而且未明顯增加不良反應(yīng)的發(fā)生率6,7。貝伐珠單抗逐漸得到認(rèn)可，為耐藥性卵巢癌和復(fù)發(fā)性卵巢癌的治療帶來(lái)了新的曙光。1.2.3 胃癌在我國(guó)各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，而臨床收治的胃癌患者大部分為晚期，每年約60萬(wàn)的患者因胃癌死亡。付紅偉8

9、研究發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗的聯(lián)合治療和單純化療相比，對(duì)胃癌患者疾病控制率有所收益，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。所以，貝伐珠單抗聯(lián)合化療是可以考慮的方案，為晚期胃癌患者治療增加了選擇。1.2.4 非小細(xì)胞肺癌貝伐珠單抗聯(lián)合鉑類是首個(gè)被臨床證實(shí)與基礎(chǔ)化療方法聯(lián)用可延長(zhǎng)晚期非鱗非小細(xì)胞惡性肺癌（NSCLC）患者生存期的血管生成抑制劑6。在多項(xiàng)成功的臨床研究證實(shí)了貝伐珠聯(lián)合鉑類化療能顯著地延長(zhǎng)肺癌患者的腫瘤生存期,使得貝伐珠單抗在晚期肺癌的治療中繼續(xù)占據(jù)重要的地位。但由于目前缺乏明確的臨床療效預(yù)測(cè)和影響因子,這一問(wèn)題成為了貝伐珠單抗在其使用的過(guò)程和治療中的一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題。1.2.5其他腫瘤多項(xiàng)臨床研究顯示貝伐珠單抗的

10、聯(lián)合治療在乳腺癌、宮頸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等其他癌癥應(yīng)用上均有一定療效，這給了臨床上除了化療外而一直沒(méi)有更好的治療選擇的癌癥的診治帶來(lái)了新的希望。但貝伐珠單抗在這些癌癥上尚處于起步階段，并沒(méi)有明確的證據(jù)證實(shí)它能延長(zhǎng)患者總生存期，在聯(lián)合用藥、治療時(shí)機(jī)及遠(yuǎn)期療效等問(wèn)題，需要進(jìn)一步研究。1.3用藥不良反應(yīng)由于應(yīng)用貝伐珠單抗會(huì)抑制VEGF，但VEGF在正常組織的生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，所以會(huì)導(dǎo)致一些反應(yīng)程度輕微的不良反應(yīng)發(fā)生，如高血壓、蛋白尿等是常見的不良反應(yīng),對(duì)癥處理即可6。但對(duì)于嚴(yán)重威脅人體的不良反應(yīng)需加大關(guān)注。1. 蛋白尿在接受貝伐珠單抗治療中，可能會(huì)因?yàn)閱慰挂种芕EGF而導(dǎo)致腎小球的濾過(guò)屏障受損，

11、蛋白尿的發(fā)生與貝伐珠單抗的劑量相關(guān)。所以根據(jù)檢測(cè)出尿蛋白水平來(lái)判斷是否中止相關(guān)貝伐珠的治療方案。2. 高血壓通過(guò)對(duì)使用貝伐珠單抗治療患者的觀察，發(fā)現(xiàn)高血壓的出現(xiàn)是常見的不良反應(yīng)之一。故在使用貝伐珠單抗治療的過(guò)程中，監(jiān)測(cè)出血壓達(dá)到正常臨界值以上，一般只需的服用抗高血壓藥物，就可以對(duì)高血壓進(jìn)行充分的控制。3. 血栓與采用單獨(dú)化療的患者進(jìn)行比較,患者在治療中接受貝伐珠單抗和化療的聯(lián)合治療后,可能會(huì)大大增加了靜脈血栓發(fā)生的幾率。如果在治療中發(fā)生了可能威脅到患者生命的靜脈栓塞發(fā)生的事件,應(yīng)該立即停用貝伐珠單抗。4. 其他使用貝伐珠單抗后可能導(dǎo)致傷口愈合緩慢、傷口開裂、致死性出血的概率會(huì)增加，出現(xiàn)嚴(yán)重及致

12、死性手術(shù)并發(fā)癥的患者應(yīng)暫停使用貝伐珠單抗。1.4 貝伐珠的發(fā)展概況貝伐珠單抗的原研藥企是羅氏（基因泰克），在2004年獲得FDA批準(zhǔn)上市。于2017、2019年FDA先后批準(zhǔn)安進(jìn)和輝瑞公司生產(chǎn)貝伐珠單抗生物類似物Mvasi和Zirabev；2019年12月中國(guó)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)齊魯藥業(yè)研制的貝伐珠單抗注射液上市，國(guó)內(nèi)還有較多藥企已經(jīng)進(jìn)入NDA、臨床三期階段，見表1。隨著不斷對(duì)貝伐珠的研究，其在抗血管生成治療領(lǐng)域中逐漸成為不可缺少單抗藥物。現(xiàn)如今使用貝伐珠單抗治療的患者超過(guò)100萬(wàn)。公司名稱適應(yīng)癥狀態(tài)公示日期信達(dá)生物NSCLC NDA2019.1百奧泰NSCLC 2019.12復(fù)宏漢霖CRC2017

13、.1嘉和生物NSCLC 2017.12恒瑞醫(yī)藥NSCLC 2018.3正大天晴NSCLC 2018.7華蘭生物NSCLC 2018.8神州細(xì)胞NSCLC 2018.12安科生物NSCLC 2019.4東耀藥業(yè)NSCLC 2017.5北京天廣實(shí)NSCLC 2017.8山東博安生物NSCLC 2018.1表1.1中國(guó)進(jìn)入臨床期及遞交NDA申請(qǐng)的貝伐珠單抗生物類似藥1.5展望根據(jù)近幾年的全球癌癥報(bào)告顯示，我國(guó)的新發(fā)癌癥人數(shù)最多。2004年貝伐單抗成功研發(fā)且在癌癥治療領(lǐng)域起到重要作用，它的需求量在全球快速增加。但是在2019年之前貝伐單抗都是從國(guó)外進(jìn)口，直到現(xiàn)如今齊魯藥業(yè)通過(guò)中國(guó)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)生產(chǎn)貝伐

14、單抗，大多企業(yè)仍處于臨床階段。因此，貝伐單抗在工業(yè)上的生產(chǎn)具有研究意義，本論文旨在研究貝伐珠單抗原液車間工廠設(shè)計(jì)，為實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)提供參考價(jià)值。本論文希望通過(guò)對(duì)發(fā)酵、純化車間設(shè)計(jì)、設(shè)備選型等，能設(shè)計(jì)出比較符合實(shí)際生產(chǎn)的貝伐單抗車間,讓生產(chǎn)效益最大化。隨著對(duì)聯(lián)合化療、分子靶向治療及多種治療手段的不斷探索，我相信貝伐珠單抗將成為癌癥治療領(lǐng)域上重要支柱。2貝伐珠單抗工藝流程設(shè)計(jì)2.1生產(chǎn)工藝流程貝伐珠生產(chǎn)工藝流程參見下圖。2.2生產(chǎn)工藝流程說(shuō)明2.2.1藥物原液（DS）藥物原液（DS）生產(chǎn)工藝流程可分為上游和下游兩部分，其中上游工藝為從種子復(fù)蘇到蛋白捕獲，下游工藝為從純化到原液收獲。2.2.1.1種子

15、復(fù)蘇將種子細(xì)胞從種子庫(kù)中取出凍存管，37下水浴解凍，并不斷的搖動(dòng)，使之迅速融化。用酒精消毒后打開，用移液槍吸出細(xì)胞的凍存液，加入事先裝好培養(yǎng)基(37預(yù)熱，810倍體積)的離心管內(nèi)以稀釋二甲基亞砜（DMSO），移液槍吹打成細(xì)胞懸液，然后在1000rpm下離心5min，去除上清液。接種于含少量培養(yǎng)基（約30ml）的一次性搖瓶中，在37、5CO2 及飽和濕度下培養(yǎng)1h，使細(xì)胞復(fù)蘇。應(yīng)用的培養(yǎng)基為Gibco公司生產(chǎn)貨號(hào)為670006的CHO Medium，規(guī)格為10kg/桶的粉末狀培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是一種不含動(dòng)物來(lái)源成分的配方，適用于研究和生產(chǎn)應(yīng)用分批工藝、補(bǔ)料分批工藝和量產(chǎn)工藝的各種生物培養(yǎng)容器。CH

16、O培養(yǎng)基基礎(chǔ)配制方法: 稱取培養(yǎng)基26.0g于含有950ml注射用水的燒杯, 緩慢攪拌使其溶解；然后加入1.9gNaHCO3;再次攪拌溶解，加注射用水定容至1L（所需pH可用NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)）；在0.2濾膜中正壓過(guò)濾除菌。2.2.1.2細(xì)胞擴(kuò)增復(fù)蘇的細(xì)胞接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)過(guò)初步培養(yǎng)后，置于多個(gè)含培養(yǎng)基一次性搖瓶中培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)，（形成約900ml的細(xì)胞液）接種密度維持在0.30.5106cells/ml，細(xì)胞活率維持在85以上，在35下自然增殖分裂細(xì)胞數(shù)量pH控制在7.27.3，培養(yǎng)24h。2.2.1.3一級(jí)反應(yīng)器培養(yǎng)待培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)至10L的一次性生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)同時(shí)加入培養(yǎng)基

17、，供細(xì)胞正常繁殖分化產(chǎn)生抗體，通入CO2和O2。考慮到實(shí)際操作過(guò)程中，種子制備體積過(guò)大會(huì)增加前期培養(yǎng)時(shí)間，使培養(yǎng)發(fā)生污染的機(jī)率增大9。所以確定反應(yīng)器中的傳代接種密度為36105cells/ml。 2.2.1.4多級(jí)反應(yīng)器培養(yǎng)采用培養(yǎng)方法為分批補(bǔ)料培養(yǎng)法，在不同培養(yǎng)時(shí)間段中添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，一次性收獲產(chǎn)品。生物反應(yīng)器培養(yǎng)分4階段，分別是10L、50L、200L、2000L，每個(gè)階段均需加入培養(yǎng)液（Gibco提供、型號(hào)670006），加入不同量的發(fā)酵液滿足不同階段的容量。種子密度達(dá)到36105cells/ml接種，通常為2d左右。在37下擴(kuò)增培養(yǎng)，第2天補(bǔ)充5%基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基（Sigma

18、-Aldrich公司提供，型號(hào)24368C）；細(xì)胞密度達(dá)到46106cells/ml，調(diào)整溫度至30左右；第 4、6、8天分別補(bǔ)10%、10%、5%基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積的補(bǔ)料培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞活力低于70%80%中止培養(yǎng)。10L、50L、200L反應(yīng)器培養(yǎng)為種子細(xì)胞培養(yǎng)階段，加入的培養(yǎng)液分別為7.5L、37.5L、150L;培養(yǎng)條件：溫度為3637，攪拌轉(zhuǎn)速為120180rpm，溶氧（DO）為30%80%和pH為7.0-7.2，總培養(yǎng)時(shí)間為6d。2000L反應(yīng)器為細(xì)胞生長(zhǎng)階段的抗體分泌階段，加入培養(yǎng)液（Gibco提供、型號(hào)670006）的量為1500L，總培養(yǎng)時(shí)間為20d。培養(yǎng)條件為：溫度為3032，溶

19、氧（DO）為30%80%、攪拌轉(zhuǎn)速為6090rpm 和pH為7.2-7.4,。2.2.1.5細(xì)胞收獲在反應(yīng)器中培養(yǎng)一定時(shí)期后，收集細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，隨后將進(jìn)行一系列的過(guò)濾層析和提純，得到所需要的抗體。2.2.1.6離心過(guò)濾將收獲的含有細(xì)胞及產(chǎn)生抗體的細(xì)胞液通過(guò)采用離心的方式將漿細(xì)胞與抗體分離開并過(guò)濾，取上清液繼續(xù)親和層析。過(guò)濾條件為：溫度2528，時(shí)間約23h。過(guò)濾器在使用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生含細(xì)胞的沖洗廢液L1，且細(xì)胞在離心過(guò)程中可能有部分會(huì)壞死，無(wú)論是否存活的細(xì)胞均被截留在過(guò)濾器中，成為固廢。2.2.1.7蛋白質(zhì)捕獲先加入平衡液到層析柱上淋洗，再用分離得到上清液加樣，然后用pH3.5洗脫緩沖液

20、洗脫層析柱填料上結(jié)合的抗體，最后用較高濃度鹽溶液去除強(qiáng)結(jié)合雜質(zhì)，使得介質(zhì)再生。將離心過(guò)濾后抗體通過(guò)親和層析進(jìn)行第一步的純化，層析溫度為1826，層析時(shí)間約23h，過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有不含抗體的細(xì)胞、緩沖液廢液L2。具體步驟如下：蛋白A介質(zhì)填充于層析柱層析柱由5cv平衡液清洗后上樣，讓樣品在柱上保留4min用3cv平衡液淋洗至A280基線，之后由5cv的緩沖液進(jìn)一步?jīng)_洗，減少了親和層析洗脫液中宿主蛋白的殘留再經(jīng)2cv平衡液沖洗去除高濃度NaCl 目標(biāo)蛋白最后由5cv蛋白洗脫液洗脫，線性流速4mL/min，1min停留時(shí)間。根據(jù)CEX-HPLC檢測(cè)結(jié)果,合并收集樣液，流速為2.0ml/min收集蛋白峰最

21、后用3cv的再生水沖洗層析柱再生，然后用3cv的消毒液沖洗層析柱，再用3cv的注射用水淋洗層析柱，保存在2cv的20%乙醇。生產(chǎn)過(guò)程條件說(shuō)明如下：層析柱：Axichrom450/550（即內(nèi)徑450mm,高度550mm）,床層體積為87.4L填料：rProtein A Sepharose Fast Flow(rPrA)，貨號(hào)17-1279-03，通用電氣公司GE。其每毫升介質(zhì)結(jié)合量為50mg，即需要60L的填料。層析系統(tǒng)：AKTAprocess全自動(dòng)可升級(jí)生產(chǎn)系統(tǒng)，型號(hào)AKTAprocess（GE公司）操作系統(tǒng)：unicorn系統(tǒng)（GE）溶液：平衡液：50 mmol/LHEPES，150mmo

22、l/L NaCl，pH7.0緩沖液：50 mmol/L HEPES，1 mol/L NaCl，pH7.0蛋白洗脫液：100 mmol/L醋酸，pH 3.5再生液：2mol/L NaCl消毒液：50mmol/L NaOH2.2.1.8病毒滅活在生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)有病毒產(chǎn)生，污染的來(lái)源可以是原細(xì)胞系本身，也可能來(lái)自過(guò)程中、培養(yǎng)基、緩沖液等原輔料10偶然帶入的外源病毒。為確保產(chǎn)品的安全性，所以需要通過(guò)病毒滅活的步驟，現(xiàn)采用分離方法如下。1. 低pH病毒滅活使病毒處于低pH環(huán)境下，改變病毒表面電荷，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變性，病毒喪失與細(xì)胞受體結(jié)合的能力，起到病毒滅活作用。目前存在容器頂部和管道壁

23、會(huì)有液滴未能接受很好的低pH病毒滅活的問(wèn)題，考慮將混勻的溶液轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)容器。2. 納濾膜多數(shù)病毒直徑在20200nm，而納米過(guò)濾膜的孔徑平均為2nm,相對(duì)分子質(zhì)量截留范圍在在2001000之間。利用膜內(nèi)有大大小小孔徑可進(jìn)行篩分，對(duì)納米膜進(jìn)行加壓來(lái)除病毒過(guò)濾。存在問(wèn)題是小孔徑的膜包被雜質(zhì)堵塞，導(dǎo)致病毒從大孔徑流出。這里主要采用低pH滅活方法，用1.5倍注射用水稀釋收集的樣品，酸性溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5左右，1826下孵放 23h，完成病毒的滅活。根據(jù)下一步陰離子交換層析需要，用高濃度、高pH值的Tris-HCl調(diào)節(jié)蛋白溶液 pH 值至7.2左右，此過(guò)程會(huì)產(chǎn)生酸性廢液L3。2.2.1.9離子交

24、換層析1.陰離子交換層析經(jīng)過(guò)初步純化后的抗體溶液繼續(xù)進(jìn)入陰離子交換層析裝置進(jìn)一步純化，它是去除內(nèi)毒素和核酸的常用方法之一。經(jīng)查閱知貝伐株單抗等電點(diǎn)pI=8.25，故選擇pH7.2 Tris-HCl緩沖液作為平衡和洗滌緩沖液。層析溫度1826,層析時(shí)間約2h，層析過(guò)程需要加入一定量的緩沖液,層析后有不需要的緩沖廢液L4產(chǎn)生。具體步驟如下：將強(qiáng)陰離子交換樹脂填充于層析柱用5cv平衡液清洗層析柱后上樣，樣品在柱上保留4min用3v平衡液淋洗至至洗出液pH接近中性，之后由5cv的緩沖液進(jìn)一步?jīng)_洗再用20cv的0%50%梯度洗脫液洗脫未結(jié)合的目標(biāo)蛋白根據(jù)CEX-HPLC檢測(cè)結(jié)果,合并收集樣液，流速為2.

25、0ml/min收集蛋白峰最后用3cv的再生水沖洗層析柱再生，然后用3cv的消毒液沖洗層析柱，再用3cv的注射用水淋洗層析柱，保存在2cv的20%乙醇。生產(chǎn)過(guò)程條件說(shuō)明如下層析柱：Axichrom450/550（即內(nèi)徑450mm,高度550mm）,床層體積為87.4L填料：POROS 50 HS強(qiáng)陰離子交換樹脂，貨號(hào)為1255911，Gibco公司，其每毫升介質(zhì)結(jié)合量為6491mg,取64mg，即需要47L的填料。層析系統(tǒng)：AKTAprocess全自動(dòng)可升級(jí)生產(chǎn)系統(tǒng)，型號(hào)AKTAprocess（GE公司）操作系統(tǒng)：unicorn系統(tǒng)（GE）溶液：平衡液：2mmol/L Tris-HCl，pH7.

26、2洗滌液：20 mmol/L Tris-HCl，pH7.2洗脫液：20mmol/L Tris-HCl +00.5mol/L NaCl，pH7.2再生液：2mol/L NaCl消毒液：50mmol/L NaOH2.陽(yáng)離子交換層析陽(yáng)離子交換層析是對(duì)抗體液進(jìn)行深度純化,去除不需要的陽(yáng)離子。在目的蛋白峰出來(lái)前立即換成低pH值的平衡液，從而在保證回收率的前提下去除大部分酸性雜質(zhì)。層析溫度1826,層析時(shí)間約2h,層析過(guò)程需要加入一定量的緩沖液,層析后有不需要的緩沖廢液L5產(chǎn)生。具體步驟如下：將強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂填充于層析柱用5cv平衡液清洗層析柱后上樣，樣品在柱上保留4min用3cv平衡液淋洗至A280基

27、線再由1倍柱體積的洗滌液進(jìn)一步?jīng)_洗，之后立即用3cv的平衡溶液洗滌層析柱再用洗脫液洗脫5cv根據(jù)CEX-HPLC檢測(cè)結(jié)果,合并收集樣液，流速為2.0ml/min收集蛋白峰最后用3倍柱體積的再生水沖洗層析柱再生，然后用3倍柱體積的消毒液沖洗層析柱，再用3cv的注射用水淋洗層析柱，保存在2cv的20%乙醇。生產(chǎn)過(guò)程條件說(shuō)明如下層析柱：Axichrom450/550（即內(nèi)徑450mm,高度550mm）,床層體積為87.4L填料：POROS 50 HS 強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂，貨號(hào)為1335911，Gibco公司，其每毫升介質(zhì)結(jié)合量為57.0-75.3 mg,取57mg，即需要53L的填料。層析系統(tǒng)：AKT

28、Aprocess全自動(dòng)可升級(jí)生產(chǎn)系統(tǒng)，型號(hào)AKTAprocess（GE公司）操作系統(tǒng)：unicorn系統(tǒng)（GE）溶液平衡液：20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH5.4洗滌液：10mmol/L Tris-HCl，pH 7.8洗脫液：50mmol/L Tris-HCl，pH8.2 再生液：2mol/L NaCl消毒液：50mmol/L NaOH2.2.1.10病毒過(guò)濾為了避免純化中外源性病毒引起單抗活性降低。這里采用納濾方法進(jìn)行病毒過(guò)濾，由GE公司提供DK8040F30型號(hào)的納濾膜。,pH值在7.27.3范圍,操作溫度2528,過(guò)濾時(shí)間約23h,濾膜沖洗過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生沖洗廢液L6。2.2.1.11超濾濃縮

29、病毒過(guò)濾后原液進(jìn)行濃縮,將可能含有緩沖液等除去,提高原液中有效成分濃度。pH值在7.27.3范圍,操作溫度2528,超濾時(shí)間約23h,超濾介質(zhì)每次使用后需沖洗，清洗中會(huì)產(chǎn)生廢液L7。超濾所用膜包（由默克公司提供，型號(hào)MC0HC10FS1）孔徑選自30kD超濾膜。2.2.1.12原液收獲為了避免微生物污染，單抗原液品生產(chǎn)的全過(guò)程要進(jìn)行微生物控制，以達(dá)到無(wú)菌目的。除菌過(guò)濾器通過(guò)利用截留和吸附性截留的方法將液體或空氣的細(xì)菌除去，過(guò)濾器在使用中需要利用一定量的注射用水進(jìn)行沖洗,產(chǎn)生沖洗廢液L8。2.2.2藥物制劑（DP）藥物制劑（DP）生產(chǎn)工藝是從制劑到成品存。原液經(jīng)配料加入一定量的注射用水及緩沖液,

30、經(jīng)化驗(yàn)合格得到合格藥液,在灌裝機(jī)半加塞后送冷凍干燥機(jī),箱體內(nèi)冷凍干燥,水分合格后在凍干機(jī)內(nèi)壓蓋,出凍干機(jī)后軋鋁蓋得成品,燈檢合格的產(chǎn)品進(jìn)入外包裝間,在貼簽機(jī)上貼簽、裝盒、裝箱送倉(cāng)庫(kù)低溫儲(chǔ)存。待檢合格后出廠。2.2.2.1制劑配料在除菌過(guò)濾后的抗體液加入相應(yīng)的制劑配方配制成的原液即為成品原液,經(jīng)過(guò)有效成分檢驗(yàn)合格即可進(jìn)行包裝,過(guò)程中有極少量的檢驗(yàn)液成為廢液L9。表2.1貝伐珠單抗注射液制劑配方成分濃度貝伐珠單抗100mg，-雙羧海藻糖5.3mg磷酸鈉1.3mg聚山梨酯204.0mg稀鹽酸（1%）0.4ml注射用水加水至4ml2.2.2.2灌裝購(gòu)買的包裝容器利用注射用水清洗,產(chǎn)生廢液L10,然后采

31、用灌裝機(jī)進(jìn)行灌裝。2.2.2.3凍干將完成上一步流程的產(chǎn)品送入凍干機(jī)冷凍干燥,凍干的任務(wù)后清洗,產(chǎn)生廢液L11。2.2.2.4壓蓋將無(wú)菌的蓋子裝入壓蓋機(jī)進(jìn)料斗，壓蓋機(jī)必須有凍干機(jī)的卸載過(guò)程同步。2.2.2.5成品檢查每批次通過(guò)統(tǒng)計(jì)抽樣檢查，確保西林瓶的完整性。2.2.2.6包裝所有包裝材料前都要適應(yīng)至環(huán)境溫度，以免操作過(guò)程發(fā)生冷凝現(xiàn)象。2.2.2.7儲(chǔ)存包裝完后，托盤將被拉伸包裹并轉(zhuǎn)移至倉(cāng)庫(kù)冷凍間儲(chǔ)存，直到質(zhì)控完成后放。3工藝計(jì)算3.1生產(chǎn)周期具體見下表表3.1工藝流程主要操作與生產(chǎn)周期序號(hào)產(chǎn)品名稱主線操作生產(chǎn)時(shí)間每周生產(chǎn)批次1DS種子復(fù)蘇、細(xì)胞接種與擴(kuò)增24h2000L發(fā)酵罐培養(yǎng)到無(wú)菌過(guò)濾為

32、17.8d23.8d，其余生產(chǎn)過(guò)程可交替進(jìn)行2上游細(xì)胞培養(yǎng)2126d3離心過(guò)濾23h4蛋白捕獲23h5病毒滅活23h6下游純化與無(wú)菌過(guò)濾23d小計(jì)24.330.4d1制劑配料3h每批生產(chǎn)時(shí)間2.8d，兩批間間隔19d2DP灌裝6h3凍干24h4壓蓋7h5檢查24h6包裝2h小計(jì)2.8d3.2貝伐珠單抗原液基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及工藝指標(biāo)參照中華人民共和國(guó)勞動(dòng)法規(guī)定，設(shè)計(jì)生產(chǎn)天數(shù)300天，生產(chǎn)周期為17.8d23.8d, 取中間值20.8d，故年生產(chǎn)批次為14個(gè)。（1）生產(chǎn)天數(shù) 300天（2）產(chǎn)品批產(chǎn)量 1500L98%2g/L=2940g（3）產(chǎn)品年產(chǎn)量 294014=41160g（4）發(fā)酵周期 20.8d

33、（5）倒罐率 2%（6）發(fā)酵罐裝液系數(shù)：75%3.3貝伐單抗原液車間的物料衡算1. 2000L發(fā)酵罐發(fā)酵液量2000L75%=1500L式中 75%酵罐裝液系數(shù)其中在2000L發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中，需要加入的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的量為1010L，由200L種子罐接種到發(fā)酵罐的量為40L，第2d、4d、6d、8d分別要補(bǔ)料5%、10%、10%、5%的培養(yǎng)液，總計(jì)450L。2. 種子液量種子罐為10L、50L、200L，逐次放大培養(yǎng)。（1）10L發(fā)酵罐發(fā)酵液量：10L75%=7.5L（2）50L發(fā)酵罐發(fā)酵液量：50L75%=37.5L（3）200L發(fā)酵罐發(fā)酵液量：200L75%=150L3. 培養(yǎng)基耗用量（1）

34、種子復(fù)蘇耗用量：30ml26g/L=0.78g式中 26為每升中加入溶解每克培養(yǎng)基的量（2）細(xì)胞擴(kuò)增耗用量：900ml26g/L=23.4g（3）種子培養(yǎng)耗用量：（7.5L+37.5L+150L)26g/L=5070g（4）發(fā)酵培養(yǎng)耗用量：（1010L+40L）26g/L+450L26g/L =39000g一批次CHO培養(yǎng)基耗用量：0.78g+23.4g+5070g+39000g=44094.18g4. NaHCO3的耗用量44094.18g26g/L1.9g/L=3222.27g5. 消泡劑的耗用量(195+1500)0.1%=1695g6. HEPES的耗用量 11.915（1060+56

35、0）=10723.5g式中 11.915HEPES的相對(duì)分子質(zhì)量g/mol7. NaCl的耗用量(Mr: 58.44g/mol)（1）緩沖液含NaCl量：58.44（0.151060+1560）+0.54720=43245.6g（2）再生液：58.442（360+347+353）=56102.4g一批次NaCl耗用量：43245.6g +56102.4g =99348g8. 99.5%乙酸的耗用量57.44l560=17.1ml式中 57.44配制1L 100mM乙酸需要99.5%乙酸的量9. Tris的耗用量(Mr: 121.14g/mol)（1）陰離子交換層析：121.140.002847

36、+121.140.02(547+2047)=2937.9g（2）陽(yáng)離子交換層析：121.140.01153+121.140.05553=1669.3g一批次Tris耗用量：2937.9g+1669.3g=4607.2g10. 36%鹽酸的耗用量（1）陰離子交換層析：0.0286847+0.0286(547+2047) =290.22ml式中 86配制1L 1MHCl需要36%鹽酸的量（2）陽(yáng)離子交換層析：0.0186153+0.0586553=1185.08ml一批次HCl耗用量：290.22ml +1185.08ml =1475.3ml11. 檸檬酸-檸檬酸鈉的耗用量(Mr檸檬酸: 210.

37、14g/mol ；Mr檸檬酸鈉: 294.12g/mol)（1）檸檬酸的耗用量: 0.02210.140.321153=784.1g（2）檸檬酸鈉的耗用量: 0.02294.120.681153=2332g12. NaOH的耗用量(Mr: 40.01g/mol)0.0540.01（360+347+353）=960.24g13. 無(wú)水乙醇的耗用量0.2（260+247+253）=64L表3.2貝伐珠單抗原液生產(chǎn)車間的物料衡算表物料名稱年產(chǎn)單抗原液物料量每批次物料量每年物料量 CHO培養(yǎng)基/kg44.09617.26NaHCO3/kg3.2245.08消泡劑k/g1.723.8HEPES k/g1

38、0.72150.08NaCl/kg99.351390.999.5%乙酸/mL17.1239.4Tris/kg4.6164.54 36%鹽酸/L1.4820.72檸檬酸/g0.7810.92檸檬酸鈉/g2.3332.62 NaOH/kg0.9613.44 無(wú)水乙醇L6464陰離子交換樹脂/L4747陽(yáng)離子交換樹脂/L53742注射用水/kg6231.3387238.624熱量平衡計(jì)算4.1熱平衡方程計(jì)算依據(jù)：（1）間歇式生產(chǎn)熱量衡算基本方程式 Q物料帶入+Q熱負(fù)荷=Q物料帶出+Q熱損失 （式4.1）（2）化學(xué)熱量衡算一般方程式 Q1+Q2+Q3=Q4+Q5+Q6+ Q7+Q8 （式4.2）式中：

39、Q1物料帶入熱量 Q2由加熱劑傳給設(shè)備和所處理的物料的熱量 Q3過(guò)程的熱效應(yīng)，包括反應(yīng)熱、攪拌熱（kJ） Q4物料帶走的熱量 Q5加熱設(shè)備消耗的熱量 Q6加熱物料需要的熱量 Q7氣體或蒸汽帶出的熱量Q8損失的熱量4.2發(fā)酵工序熱量衡算4.2.1發(fā)酵罐空消蒸汽用量(1) 發(fā)酵罐體加熱用蒸汽量發(fā)酵罐體積2000L，在0.2MPa蒸汽(表壓)下滅菌，從20加熱至127，時(shí)間為1h。其蒸汽用量為： D加熱=6000.5（twt1)1kcal(It2)1kcal=6000.5（12720）4.18（652127）4.18 =61.1kg （式4.3）式中 600發(fā)酵罐罐體重量kg0.5發(fā)酵罐為的不銹鋼比

40、熱容kJ/(kg)1kcal=4.186kJ I0.2MPa(表壓)蒸汽焓kcal/kg(2)填充發(fā)酵罐空間所需蒸汽量2m3發(fā)酵罐全容積大于2m3，考慮到罐內(nèi)配件也占有一定罐內(nèi)體積，罐體積依舊按2m3計(jì)算，填充空間所需蒸汽用量： D填充= V發(fā)酵罐蒸汽 =21.704 =3.4kg （式4.4）式中V發(fā)酵罐自由空間即全容積(m3)加熱蒸汽密度（kg/m3）(3)滅菌過(guò)程的熱損失設(shè)發(fā)酵罐由20升溫到127，外壁溫度為70，此時(shí)輻射與對(duì)流聯(lián)合給熱系數(shù)為=33.90.19（70-20）=43.4kJ/（m2hK） 2m3發(fā)酵罐的表面積為6.3m2，消耗蒸汽量為： D損 =S（twt1)1kcal(I

41、t2)1kcal=6.343.470204.186521274.18=26kg （式4.5）(5)滅菌過(guò)程蒸汽滲漏，為總蒸汽消耗量的5%，空罐滅菌總體消耗量為61.1+3.4+2610.05=95.3kg/h(5)每空罐滅菌1h，用蒸汽量95.31 =95.3kg/罐4.2.2種子罐空消蒸汽用量(1)同理，種子罐加熱用蒸汽量10L： D加熱=100.5（12720）4.18（652127）4.18 =1.01kg50L： D加熱=1000.5（12720）4.18（652127）4.18 =10.18kg200L： D加熱=2600.5（12720）4.18（652127）4.18 =26.4

42、8kg(2)填充發(fā)酵罐空間所需蒸汽量10L： D填充= V種子罐蒸汽 =0.011.704 =0.02kg50L： D填充= V種子罐蒸汽 =0.21.704 =0.34kg200L： D填充= V種子罐蒸汽 =0.51.704 =0.85kg(3)滅菌過(guò)程的熱損失10L： D損 = 0.2543.4（7020）4.18（652127）4.18=1.03kg50L： D損 = 3.1443.4（7020）4.18（652127）4.18=12.96kg200L： D損 = 3.0743.4（7020）4.18（652127）4.18=12.67kg(4)滅菌過(guò)程蒸汽滲漏，為總蒸汽消耗量的5%，

43、空罐滅菌總體消耗量為10L： 1.01+0.02+1.0310.05=2.17kg/h50L： 10.18+0.34+12.9610.05=24.72kg/h200L： 26.48+0.85+12.6710.05=42.11kg/h(5)每空罐滅菌1h，用蒸汽量10L： 2.171 =2.17kg/罐50L： 24.721 =24.72kg/罐200L： 42.111 =42.11kg/罐5水平衡計(jì)算注射用水的用量計(jì)算主要用于發(fā)酵車間和純化車間，考慮到在其他具體的工藝上注射用水大部分用于儀器的沖洗且在生產(chǎn)過(guò)程中有用水的損耗，故取這些注射用水消耗量之和等于發(fā)酵車間和純化車間用量的10%。1.發(fā)酵

44、車間耗水量發(fā)酵車間的耗水量為等于擴(kuò)增是需要培養(yǎng)液、發(fā)酵液和種子液的體積。0.03+0.9+1500+190=1695.93（kg/批）2. 純化車間水的耗用量（1）蛋白捕獲水的耗用量主要為親和層析所需配置緩沖液、消毒液、再生液、沖洗親和介質(zhì)使用注射用水的量。6cv平衡液+5cv緩沖液+3cv洗脫液+3cv消毒液+3cv沖洗=600+300+180+180+180=1440（kg/批）（2）陰離子交換層析離子交換層析耗水量大致與親和層析耗水量計(jì)算步驟一樣，除了離子交換層析所用的平衡液為 Tris-HCl溶液，配置中HCl溶液是直接購(gòu)買使用。（8cv平衡液+5cv緩沖液+20cv洗脫液-HCl溶液

45、）+3cv消毒液+3cv沖洗=（376+235+940-0.29）+141+141=1832.7（kg/批）（3）陽(yáng)離子交換層析11cv平衡液+（1cv緩沖液+5cv洗脫液-HCl溶液）+3cv消毒液+3cv沖洗=583+（53+265-1.19）+159+159=1217.81（kg/批）3.注射用水每批消耗量（1695.93+1440+1832.7+1217.81）（1+0.1）=6805.1（kg/批）4. 注射用水年消耗量6805.114=95271.18（kg/a）6氧氣物料平衡歸納發(fā)酵車間的氧氣物料平衡，我們可以簡(jiǎn)潔的總結(jié)為所通入發(fā)酵反應(yīng)器的所有氧氣都被細(xì)胞消耗掉了，除了從尾氣中排

46、放出去的氧氣。 Q=發(fā)酵罐體積通氣速率填充系數(shù)=275%0.65=0.975m3/ （式6.1） OUR=Q(cincout)V （式6.2）式中 0.652000L規(guī)模的通氣發(fā)酵罐的通氣速率vvm OUR耗氧速率 molO2/(m3） Q通氣量 (m3/） cin通入發(fā)酵罐的空氣氧濃度（molO2/m3) cout離開發(fā)酵罐的空氣氧濃度molO2/m3 V通發(fā)酵罐裝液量（m3） 通常，cin就是大氣的氧濃度9.69molO2/m3，而cout可根據(jù)氧的利用率計(jì)算，且cout=0.850.9cin 。取cout=0.85cin，可得OUR=0.159.690.9751.5=0.95molO2/

47、(m3）二氧化碳的物料平衡計(jì)算涉及加入培養(yǎng)液中緩沖體系中CO3-的濃度、細(xì)胞呼吸、通入CO2量，計(jì)算比較麻煩，故不做詳細(xì)計(jì)算，實(shí)際操作主要根據(jù)中監(jiān)測(cè)溶液pH值高低來(lái)確定通入CO2的量。7主要大型設(shè)備選型7.1發(fā)酵罐及種子罐的選擇根據(jù)所述生產(chǎn)工藝流程，選擇種子細(xì)胞的培養(yǎng)及抗體分泌的反應(yīng)器為GE Healthcare提供的XDR一次性生物反應(yīng)器。反應(yīng)器的具體規(guī)格如表7.1所示：表7.1生物反應(yīng)器參數(shù)生物反應(yīng)器XDR-10XDR-50XDR-200XDR-2000罐內(nèi)徑8122248H/D1.52.51.51.5葉輪底部錨定、磁力驅(qū)動(dòng)的一次性葉輪，整合反應(yīng)袋裝置葉輪直徑5.48.58.516.5pH

48、范圍2-12pH值單位，準(zhǔn)確度0.5pH單位DO范圍0-200%大氣飽和，準(zhǔn)確度0.1%溫度范圍4-60,準(zhǔn)確度0.1攪拌（rpm)10-8000-3600-3600-115寬（cm)32111133180厚（cm)357194155高（cm)881872163577.2其他設(shè)備主要參數(shù)1.工業(yè)層析系統(tǒng)KTAprocess的主要參數(shù)，如表7.2所示表7.2KTAprocess層析系統(tǒng)參數(shù)系統(tǒng)規(guī)格系統(tǒng)參數(shù)內(nèi)徑9.4 mm，不銹鋼13-600 L / h波長(zhǎng)范圍單波長(zhǎng)為280 nmpH 范圍0-14電導(dǎo)范圍1-200 mS / cm 最大操作壓力0.3兆帕 長(zhǎng) 寬 高（mm）1205 850 16

49、702.AKTA flux過(guò)濾系統(tǒng)的主要參數(shù)，如表7.3所示表7.3層析過(guò)濾系統(tǒng)參數(shù)一般規(guī)格KTA ux 6尺寸 (L b h)680520800mm儲(chǔ)液罐體積8 L相數(shù)單相管路尺寸mm內(nèi)徑 6.4 外徑 12.7 物料流量范圍100-6000 mL/min輸送流量范圍20-1000 mL/min濾出流量范圍20-1000 mL/min滯留體積120 mL3.三足離心機(jī)的主要參數(shù)，如表7.4所示表7.4離心機(jī)參數(shù)產(chǎn)品類型三足離心機(jī)型號(hào)SS1500直徑mm1500高度mm450攔液般口徑mm600轉(zhuǎn)速圖r/min360工作容積L400裝料極限kg300分離因數(shù)W2R/g3200尺寸mm(L b

50、h)2640 1850 11004.二氧化碳箱的主要參數(shù)，如表7.5所示表7.5二氧化碳箱參數(shù)產(chǎn)品類型水套式二氧化碳箱型號(hào)IL-185VT溫度范圍185LCO2控制范圍0-20%CO2進(jìn)氣過(guò)濾效率99.998%內(nèi)部增濕水盤3L相對(duì)濕度953%外型尺寸mm6606401105內(nèi)腔尺寸mm540505680不銹鋼隔板4塊5. 雙扉凈化干熱滅菌柜的主要參數(shù)，如表7.6所示表7.6干熱滅菌柜參數(shù)產(chǎn)品類型雙扉干熱滅菌柜型號(hào)DMH-5A內(nèi)腔尺寸mm （寬 深 高）1000 1800 1400外形尺寸mm （寬 深 高）2100 2150 2500循環(huán)風(fēng)量變頻調(diào)節(jié)最大（m/h）5600補(bǔ)充風(fēng)量變頻調(diào)節(jié)最大(

51、m/h)504冷卻水用量（kg/ 批）3007.3車間平面布局 8總結(jié)本設(shè)計(jì)貝伐珠單抗體選用CHO細(xì)胞株發(fā)酵培養(yǎng)，采用商業(yè)化培養(yǎng)基為原料進(jìn)行分批流加培養(yǎng)。根據(jù)選定2000L發(fā)酵罐及每批次生產(chǎn)時(shí)間計(jì)算出年產(chǎn)41.16kg單抗原液。為了保證生產(chǎn)水平和縮短發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵車間的主要流程是是將復(fù)蘇的種子細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增后在10L、50L、200L、2000L生物反應(yīng)器逐級(jí)放大培養(yǎng)。最后對(duì)發(fā)酵液通過(guò)一系列純化工藝來(lái)提高蛋白濃度，減少內(nèi)毒素、核酸、ProteinA 和宿主蛋白等雜質(zhì)污染風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過(guò)物料衡算，確定按照每年產(chǎn)量41.16kg單抗原液，每14天投放一個(gè)批次。每批次投料量102.6kg，每批次得到產(chǎn)品為1470L單抗原液。本設(shè)計(jì)進(jìn)行了熱量衡算，反應(yīng)要的熱量主要為發(fā)酵罐、種子罐空消耗熱，需要蒸汽用量為2160.2kg/a; 經(jīng)水平衡計(jì)算，耗水量主要為發(fā)酵車間及純化車間，需要注射用水為87238.62kg/a；經(jīng)無(wú)菌壓縮空氣在發(fā)酵過(guò)程中衡算，發(fā)酵車間氧氣耗用速率0.95m