siRNA沉默人類血紅素敏感基因1對膀胱癌T24細胞的影響湯磊1李瑞曉于垂恭袁建林武國軍#湯磊：第四軍醫大學，西京醫院泌尿外科，碩士研究生，710032，email：李瑞曉：第四軍醫大學，西京醫院泌尿外科，碩士研究生，710032于垂恭：第四軍醫大學，西京醫院泌尿外科，博士研究生，710032袁建林：第四軍醫大學，西京醫院泌尿外科，醫學博士，科室主任，博士生導師，710032武國軍：第四軍醫大學，西京醫院泌尿外科，醫學博士，科室副主任，碩士生導師，710032email：siRNA沉默人類血紅素敏感基因1對膀胱癌T24細胞的影響湯磊1李瑞曉于垂恭袁建林武國軍#1第四軍醫大學西京醫院泌尿外科，710032()#第四軍醫大學西京醫院泌尿外科，710032（）摘要目的觀察人類血紅素敏感基因1（HRG-1）基因在膀胱正常組織和膀胱腫瘤組織中的表達情況，通過RNA干擾技術抑制HRG-1在膀胱癌T24細胞表達水平，觀察生長增殖的變化。方法應用免疫組化SP法檢測85例膀胱腫瘤（膀胱乳頭狀瘤25，低級別膀胱癌30，高級別膀胱癌30）和20例膀胱正常組織石蠟標本中HRG-1表達情況，并進行相關臨床病理分析。設計針對HRG-1基因的siRNA，轉染膀胱癌T24細胞，應用免疫印跡法和RT-PCR分析HRG-1siRNA的表達，MTT和流式細胞術（FCM）檢測增殖凋亡的變化。結果正常膀胱組織和膀胱癌組織中HRG-1表達有顯著性差異(P0.05)；HRG-1的陽性表達與膀胱腫瘤病例分級、臨床分期之間有顯著性差異(P0.05)；轉染siRNA后，HRG-1表達水平下降，MTT和FCM檢測發現，細胞增殖曲線受到抑制，HRG-1-siRNA組與空載體轉染組及未轉染組比較，細胞凋亡比例增加，差異均具有統計學意義(p0.01)。結論HRG-1基因可能參與了膀胱癌的發病，siRNA-HRG-1處理T24細胞后，細胞的增殖受到抑制，同時凋亡比例增加。關鍵詞：膀胱腫瘤，人類血紅素敏感基因，RNA干擾基因，細胞凋亡siRNAInterferenceofHRG-1onbladdercancerT24invitroTANGLei*，LIRui-xiaoYUChui-gong,YUANJian-lin,WUGuo-jun，eta1*DepartmentofUrology，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，ChinaCorrespondingauthor：WuGuo-jun(email:)AbstractObjectiveToobservetheHRG-1geneexpressionincarcinomaofurinarybladderandnormalurinarybladdertissues，andtoinvestigatetheeffectofHRG-1-siRNAontheproliferationandapoptosisofhumanbladdercancercellline.MethodsImmunohistochemistywasusedtodetecttheexpressionofHRG-1in85casesofbladdercarcinomaand20normalbladdertissues,andThesiRNAofHRG-1wasdesigned,synthesizedandtransfectedintobladdercancercelllineT24.ResultsTheHRG-1geneexpressionhadsignificantdifferencesbetweenbladdercarcinomaandnormalbladdertissues(p0.05)；HRG-1genepositiveexpressionhadmarkeddifferencesbetweenthepathologicalgradesandclinicalstagesofbladdercarcinoma(p0.05).AftertreatedwithsiRNA,theexpressionlevelofHRG-1proteinandHRG-1mRNAinT24cellsdecreasedobviously(p0.05).TheapoptosisrateofT24cellstransfectedwithHRG-1-siRNAwassignificantlydifferentfromControl-siRNAgroupandblankgroup(p80%為+。選取具有代表性視野采集圖片。1.4細胞培養人膀胱癌細胞株T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1均購買于中國科學院上海細胞庫。膀胱癌細胞株T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮細胞SV-HUC-11常規復蘇后，在10%胎牛血清的1640培養液中培養，培養條件：在5%二氧化碳濃度、飽和濕度及37下進行。1.5蛋白印跡檢測(Western-blot)蛋白裂解液提取細胞總蛋白。按BCA法進行總蛋白定量，取5ug蛋白質總量樣品進行120g/L的SDS-PAGE凝膠電泳后將凝膠轉移到硝酸纖維膜(NC)膜上，麗春紅染色觀察轉膜的效果，標記Marker的位置。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，鼠抗人HRG-1單克隆一抗、鼠抗人GAPDH多克隆一抗室溫孵育1h，4過夜，選用熒光素標記的兔抗鼠二抗，室溫孵育1h，然后使用計算機-熒光掃描儀系統對膜進行掃描，保存結果留待分析。1.6siRNA分析T24細胞常規接種于6孔板，用不含雙抗的培養液培養，細胞長滿60-80%后，通過脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)轉染siRNA于T24細胞。siRNA-HRG-1（NM-017842），HRG-1-siRNA序列為：5-GUGGUCUCCCAGGAAGCUGUdTdT-3,5-ACAGCUUCCUGGGAGACCACdTdT-3，Control-siRNA序列為：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3,反義鏈為5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3。操作嚴格按照產品說明書操作。37孵育6h后，跟換培養液，繼續孵育。通過RCR和western檢測HRG-1基因沉默水平。1.7反轉錄PCR分析胰酶消化收集對數生長期的細胞，每1107細胞加1mlTrizol裂解液(TaKaRa公司)，其余步驟嚴格按產品說明書操作，提取的總RNA經紫外分光光度計定量后，逆轉錄成cDNA。逆轉錄產物用于聚合酶鏈反應(PCR)，引物合成與北京奧科公司合作完成，HRG-1引物序列為：5-ATGCCCACCGCTACCGGGCT-3。5-CTACACCTTGACCTCTTGAC-3，理論擴增長度360bp，GAPDH引物序列為：5-AGGTCCACCACTGACACGTT-3，5-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3。反應條件如下：HRG-1循環參數為95變性5min，9530S、5930S、7230S(35個循環)，727min；GADPH循環參數為95變性5min，9530S，5730S，7230s(30個循環),727min。各取30ulPCR反應液在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠(EB)染色后照相。KodakDigitalScienceID軟件系統掃描。1.8增殖凋亡檢測MTT:收集對數生長期的細胞，包括siRNA處理的T24細胞（轉染24h后），以1104/ml接種于96孔板中，每孔加入200ul，每板接種6個復孔，1640培養基培養。12h后選擇一塊，每孔加入20ul（5mg/ml）MTT試劑。37C孵育4h，棄上清，每孔加入150ulDMSO，震蕩10min，490nm波長測吸光度值，取平均值；以后每隔12h，取出一塊板，重復上述操作。FCM:將T24細胞以5105接種于6孔板中，siRNA處理24,48h后，收獲細胞轉移至離心管，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，無水乙醇固定，并設空白對照。然后用350ul結合緩沖液重懸細胞，每組處理細胞分別加入10ul碘化丙錠(PI)和凋亡檢測試劑5ulAnnexinV-FITC(Bipec公司)，4下避光染色15min，上機檢測。細胞周期凋亡分析采用美國BectonDiekinson公司的CellQuitPlot分析軟件分析細胞增殖和凋亡的變化。1.9統計學處理采用SPSS170統計軟件分析，采用了卡方檢驗、單因素方差分析及多樣本兩兩比較采用SNK-q檢驗,以p0.05為差異有統計學意義。2結果2.1HRG-1基因在膀胱腫瘤組織和正常膀胱組織中的表達HRG-1的陽性反應物質主要在胞漿內。HRG-1在膀胱正常組織中的陽性表達率為25(5/20)，而在膀胱腫瘤組織中的陽性表達率為71.8(61/85)，兩組表達率差異有統計學意義(X2=15.166，P0.001)，可認為HRG-1在膀胱腫瘤組織中陽性表達率高于膀胱正常組織(表1，圖1)。HRG-1的表達水平與性別、年齡無相關性，與臨床病理分級呈正相關（r=0.38，p0.01），也就是說，HRG-1的陽性表達強度隨著腫瘤惡性程度的增高而加強（表2）。2.2HRG-1在不同膀胱癌細胞株的表達水平Western-blot結果顯示：在蛋白的表達水平上，4種不同細胞株HRG-1都有表達，且3個膀胱癌細胞株中的表達均高于人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-11，3個膀胱癌細胞株中，以T24的HRG-1表達水平最高，而5637、BIU-87的表達水平相當且低于T24(圖2)。2.3siRNA處理T24細胞株后，HRG-1基因表達水平檢測測得最佳感染濃度和最佳感染時間為40nm，48h。HRG-1的mRNA和蛋白表達水平通過RT-PCR和western來檢測。與空載體轉染組和未轉染組相比，HRG-1的表達水平通過siRNA處理后，表達下降。HRG-1-siRNA轉染組與空載體轉染對照組及未轉染組T24細胞相比較，T24細胞中HRG-1蛋白水平和mRNA明顯下降，差異均具有統計學意義(p0.05)(圖3)。2.4siRNA處理T24細胞株后，對細胞增殖凋亡的影響T24細胞株轉染24h后，MTT檢測發現：siRNA處理T24細胞后，HRG-1-siRNA較其空載體組和空白組的細胞增殖受到明顯抑制，差異有統計學意義（p0.01）（圖4）。FCM檢測發現：轉染24h后，HRG-1-siRNA凋亡率為(12.872.04)%，對照組為(3.371.07)%，空白組為(3.340.88)%；48h后，HRG-1-siRNA凋亡率為(14.732.16)%，對照組為(3.670.94)%，空白組為(3.721.13)%。感染組細胞凋亡較對照組和空白組凋亡比例明顯增加，差異有統計學意義（p0.01）,表明HRG-1-siRNA可促使T24細胞發生凋亡(圖5)。3討論膀胱癌是我國泌尿系腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，是繼前列腺癌、肺癌、結腸癌之后，為男性高發惡性腫瘤第四位。在女性惡性腫瘤亦排在十位之后4。肉眼血尿是膀胱癌最常見的臨床癥狀，尤其是出現間斷性全程無痛血尿時應考慮到膀胱癌的可能。2001年Elbashir等首次把特異性的siRNA轉入人癌細胞中，結果發現靶向蛋白的表達量比轉染下降了90%5。近年來，siRNA的研究受到廣泛的關注。HRG-1是人類溶質轉運蛋白SLC家族的一個新成員，以前一直作為假定蛋白存在，其功能和作用還一直不為人們所知，直到2008年，Rajagopal6等利用秀麗隱桿線蟲和相關寄生蟲具有天然的血紅素營養缺陷性，敲除斑馬魚HRG-1基因，發現其出現了腦積水等情況，而且，重度紅細胞生成表型缺陷可被HRG-1蛋白修復，這些實驗證實HRG-1所表達的蛋白是蠕蟲及脊椎動物細胞內血紅素的穩態和正常生長發育所必需的。因此將其正式命名為HRG-1（heme-responsivegene1）。本實驗發現，HRG-1基因在膀胱癌中發揮著重要的作用。免疫組化發現HRG-1的陽性表達率在膀胱腫瘤組織中明顯低于正常膀胱組織，表達水平與年齡性別無相關性，與腫瘤病理分期呈負相關。Western-blot檢測均發現3種膀胱癌細胞株(T24、5637和BIU-87)的HRG-1表達水平均高于人膀胱上皮細胞(SV-HUC-11)，T24的表達量為最高，我們利用siRNA干涉技術處理T24細胞，實現HRG-1基因的瞬時低表達，通過MTT和FCM檢測發現，HRG-1-siRNA可以抑制T24細胞的增殖，凋亡比例增加。這表明下調HRG-1的表達水平，可以抑制膀胱癌細胞的增殖，凋亡比例增加。通過HRG-1基因的相關研究的報道，我們猜測，HRG-1基因作為血紅素敏感性基因，它可能是通過細胞的分化、呼吸、代謝等生物學進程來調節細胞的發生和發展影響血紅素轉運的同時影響到血紅素對細胞的分化作用7-10；其次，HRG-1作為一種跨膜蛋白，可能影響著細胞的攜氧能力，從而影響著血管的形成，這也可能是它在癌組織中高表達的原因之一，這也為膀胱癌的診斷和治療提供了一定的可能性。1A.KarimKader.BladderCancer.TheScientificWorldJOURNALJ.(2011)11,256525662WangYong,ShaoChen,ShiChanghong,ZhangLei,QinWeijun,LiFan.ChangeofthecellcyclerelatedafterflutiamidetreatmentinprostatecancercellsanditsmolecularmechanismJ.AsianJofAndrol,2005,7(4):375-3803SHAOC，WANGY，YUEHH，eta1Biphasiceffectofandrogensonprostatecancercellsanditscorrelationwithandrogenreceptorcoactivatordopadecarb0xylaseJJAndrol，2007，28(6)：8048124JemalA,SiegelR,WardE,etal.Cancerstatistics2008J