第三節(jié)基因工程的常規(guī)技術

雜交技術PCR技術

凝膠電泳技術

基因文庫構建2.3基因工程的常規(guī)技術一凝膠電泳技術凝膠電泳：用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠等作為介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳技術。凝膠電泳的原理：分離原理-在電場的作用下，DNA分子在瓊脂糖凝膠中移動時，有電荷效應和分子篩效應。檢測原理-溴化乙錠（EB）在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當用EB對DNA樣品染色時，加入的EB就插入DNA分子中，熒光強度與DNA含量成正比。2.3基因工程的常規(guī)技術影響瓊脂糖凝膠電泳的因素：DNA片段的大小凝膠的類型凝膠的濃度電泳緩沖液電壓2.3基因工程的常規(guī)技術瓊脂糖凝膠電泳裝置：

2.3基因工程的常規(guī)技術瓊脂糖凝膠電泳裝置：2.3基因工程的常規(guī)技術凝膠成像分析系統(tǒng)：

2.3基因工程的常規(guī)技術DNA電泳圖譜

RNA電泳圖譜

2.3基因工程的常規(guī)技術重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kbpUC18

2.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’ori4.0kb2.7kb5.4kbL1L24.0kbPH2.3基因工程的常規(guī)技術聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置及其原理示意圖

2.3基因工程的常規(guī)技術SDS電泳圖譜

2.3基因工程的常規(guī)技術1975，EdwenSouthern提出分子印跡概念。概念：將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）于固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術。目前主要應用于DNA，RNA，蛋白質(zhì)的檢測。二雜交技術2.3基因工程的常規(guī)技術2.3基因工程的常規(guī)技術核酸分子雜交的基本原理：具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。2.3基因工程的常規(guī)技術DNA-DNA雜交雙鏈分子2.3基因工程的常規(guī)技術DNA印跡技術Southernblotting

基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，將含有DNA片斷的凝膠放入變性溶液變性后，將硝酸纖維膜(NC)膜放在膠上，上面放吸水紙巾，利用毛吸作用使膠DNA轉(zhuǎn)移質(zhì)NC膜上，然后利用雜交技術檢測NC膜上的DNA片斷。2.3基因工程的常規(guī)技術SouthernBlotting:GelTransfer2.3基因工程的常規(guī)技術2.3基因工程的常規(guī)技術Southernblot2.3基因工程的常規(guī)技術RNA印跡技術Northernblotting

與Southernblotting相似，但不需要限制性內(nèi)切酶切割。用于基因表達的特異性分析和定量分析。

2.3基因工程的常規(guī)技術酵母轉(zhuǎn)化子Northern雜交結(jié)果2.3基因工程的常規(guī)技術蛋白質(zhì)免疫印跡法Westernblotting:

免疫印跡法是檢測蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白質(zhì)的定性方法，也可以作為確定同一蛋白質(zhì)在不同細胞或者同一種細胞不同條件下的相對含量的半定量方法。由于其檢測往往需要抗體，所以也被稱為免疫印跡技術。應用

1檢測樣品中特異蛋白存在與否

2細胞中特異蛋白的半定量分析

3蛋白質(zhì)分子相互作用的研究2.3基因工程的常規(guī)技術原理：蛋白質(zhì)組分經(jīng)SDS分離后，平行轉(zhuǎn)移到固相支持體（NC膜或PVDF膜）上，通過免疫試劑來檢測靶蛋白。靶蛋白的檢測通常采用兩步法或間接法，用一抗結(jié)合靶蛋白，再用過氧化物酶（HRP）標記的二抗結(jié)合一抗，然后HRP催化化學顯色反應或化學發(fā)光反應。2.3基因工程的常規(guī)技術2.3基因工程的常規(guī)技術三PCR技術2.3基因工程的常規(guī)技術PCR技術的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。2.3基因工程的常規(guī)技術KaryB.Mullis（1944－）2.3基因工程的常規(guī)技術2.3基因工程的常規(guī)技術PCR技術的基本原理無細胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

2.3基因工程的常規(guī)技術PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火2.3基因工程的常規(guī)技術PolymeraseChainReaction(PCR)2.3基因工程的常規(guī)技術引物設計：（1)序列應位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-30bp為宜（171.5×1010bp）。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制。2.3基因工程的常規(guī)技術

總體積50-100lBuffer緩沖液

dNTP原料

Primer引物（0.1-0.5mol/L）

DNA分子模板（50-100ng）

Taq酶DNA聚合酶（0.5-2.5U/50L

）

反應體系：2.3基因工程的常規(guī)技術經(jīng)典循環(huán)參數(shù)：94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次

72℃7min4℃2.3基因工程的常規(guī)技術用途廣泛：生命學科醫(yī)學工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學考古學2.3基因工程的常規(guī)技術四基因文庫構建基因文庫的基本概念基因文庫的構建程序基因組文庫重組克隆的排序2.3基因工程的常規(guī)技術基因文庫（genelibrary）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為：

基因組文庫（含有全部基因）cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構基因）●●2.3基因工程的常規(guī)技術基因文庫構建的基本戰(zhàn)略用cDNA法構建cDNA文庫，材料來自mRNA

在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。●用鳥槍法構建基因組文庫，材料來自染色體DNA●2.3基因工程的常規(guī)技術基因文庫的構建程序●基因組DNA的制備

為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。2.3基因工程的常規(guī)技術●基因組DNA的切割

用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)

第二，保證DNA片段大小均一2.3基因工程的常規(guī)技術●載體和受體的選擇

出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的λ-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體。

由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質(zhì)粒。

用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌。2.3基因工程的常規(guī)技術●從基因文庫中篩選目的基因

大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白