馬鈴薯莖葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定高效液相色譜-質譜法2021-10-11發布2022-05-01實施I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國標準化研究院提出并歸口。本文件起草單位：中國計量大學、深圳市標準技術研究院、重慶兩江創享醫藥檢驗認證科技有限公司、北京電子科技職業學院、食藥環檢驗研究院(山東)集團有限公司、中國標準化研究院、華測檢測認證集團股份有限公司、中山內得農業科技有限公司、云南農業大學、浙江大學、中國熱帶農業科學院分析測試中心、中關村國際醫藥檢驗認證科技有限公司、江蘇黃淮農業科技有限公司。1馬鈴薯莖葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定高效液相色譜-質譜法本文件規定了用高效液相色譜-質譜測定馬鈴薯莖葉及其加工制品中總茄尼醇含量的測定原理、試本文件適用于馬鈴薯莖葉及其加工制品中總茄尼醇含量的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T8855新鮮水果和蔬菜取樣方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。用正己烷提取馬鈴薯葉中的游離茄尼醇(包含酯態),總茄尼醇用氫氧化鈉皂化以釋放出結合態的茄尼醇，然后用水去除雜質，離心分離，取上層溶液用流動相稀釋定容，經濾膜過濾后用高效液相色譜-質譜儀測定，外標法定量計算。5試劑和材料除另外有規定外，所用試劑均為分析純，水應符合GB/T6682中一級水的要求。5.1正己烷(C?H?):分析純。5.3異丙醇(C?HsO):色譜純。5.4氫氧化鈉(NaOH):分析純。5.5無水乙醇(C?H?O)分析純。5.6茄尼醇標準品(C?H?O,CAS號：13190-97-1):純度≥98%。5.7NaOH乙醇溶液(0.02mol/L):稱取0.4g氫氧化鈉(5.4),溶于無水乙醇(5.5),用無水乙醇稀釋至5.8流動相：甲醇(5.2):異丙醇(5.3)=50:50(體積比),使用前經有機相濾膜(5.11)過濾，超聲脫氣。5.9茄尼醇標準儲備液(500μg/mL):稱取50mg茄尼醇標準品(5.6),精確至0.0001g,置于100mL2棕色容量瓶(5.13)中，用正己烷(5.1)溶解并定容至刻度線，混勻。標準儲備液避光保存于4℃冰箱備用，有效期3個月。5.10茄尼醇系列標準工作溶液：分別準確移取適量茄尼醇標準儲備液(5.9)于50mL棕色容量瓶(5.13)中，用流動相(5.8)稀釋并定容至刻度線，搖勻，得到茄尼醇系列標準工作溶液(質量濃度分別為5.12離心管：50mL(螺旋蓋),10mL(具塞)。6儀器和設備6.1渦旋振蕩器。6.2超聲波清洗器，功率不低于250W,或相當的設備。6.3離心機(轉速不低于4000r/min)。6.4恒溫振蕩器，可水浴加熱(0℃~100℃)。6.5高效液相色譜-質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)。6.6分析天平，感量0.0001g。7測定步驟注意：本章所述操作應避免陽光直射或在強光下操作。7.1樣品前處理7.1.1馬鈴薯葉按照GB/T8855中取樣過程。稱取約1g試樣(見7.1.1.1)于50mL離心管(5.12)中，精確至0.01g,加入30mL正己烷(5.1),用渦旋振蕩器(6.1)渦旋振蕩2min,旋緊蓋子，靜置30min后，用超聲波清洗器(6.2)于45℃超聲萃取試樣30min,3500r/min離心5min,移取上清液入50mL棕色容量瓶(5.13)中。再分2次各用5mL正己烷(5.1)重復以上振蕩、萃取和離心步驟，合并上層正己烷層于50mL棕色容量瓶(5.13)中，用正己烷準確移取4mL提取液(見7.1.1.2)于50mL三角瓶(5.14)中，精確至0.1mL,加入4mLNaOH乙醇溶液(5.7),充分混勻，輕塞塞子，在恒溫振蕩器(6.4)中60℃~65℃水浴振蕩、皂化2h;皂化后溶液在83℃~87℃水浴蒸發至近干；準確移取2mL正己烷于上述三角瓶中，超聲2min溶解殘渣，轉移至另一潔凈10mL離心管(5.12)中。重復以上自“準確移取2mL正己烷……中”,溶解三角瓶中殘留物轉移至離心管(5.12)中，再用約6mL水，分3次每次2mL洗滌三角瓶，合并溶液于離心管(5.12)中；渦旋振蕩器離心管2min以去除3水溶性雜質，離心10min分層；準確移取1mL凈化后上層正己烷提取液，用流動相(5.8)稀釋并定容至25mL棕色容量瓶(5.13)中(如茄尼醇濃度超出標準曲線線性范圍，則適當調整移取體積和定容體積),經有機相濾膜(5.11)過濾，濾液待上機測定。分別稱取約0.1g(精確到0.0001g)馬鈴薯葉提取物1(70%馬鈴薯葉提取液)、馬鈴薯葉提取物2(15%馬鈴薯葉提取液)置于10mL燒杯中，用正己烷溶解，并轉移至50mL的棕色容量瓶(5.13)中，用正己烷定容，搖勻。再根據7.1.1.3的實驗步驟提取馬鈴薯葉提取物中的茄尼醇。7.2樣品測定7.2.1高效液相色譜-質譜參考條件液相色譜條件如下：a)色譜柱：Cis,150mm×2.1mm(內徑),粒徑3.5μm,或性能相當者；b)流動相：甲醇十異丙醇(50%+50%);g)等度洗脫質譜條件如下：a)定性：正離子全掃描模式，提取離子m/z為653.6;b)定量：選擇離子掃描模式，m/x為653.6;f)噴霧電壓：3500V;g)套管透鏡電壓：91V。7.2.2液相色譜-質譜測定分別取適量的茄尼醇系列標準工作溶液(5.10)及待上機試樣溶液，按照7.2.1列出的條件進行液相色譜-質譜分析測定。由保留時間和m/x對茄尼醇進行定性，根據茄尼醇標準工作溶液響應信號和茄尼醇系列標準工作溶液(5.10)濃度，建立標準工作曲線，標準工作曲線線性相關系數R2≥0.997。使用外標法對試樣的茄尼醇含量進行定量計算。待測樣液中茄尼醇的響應值應在標準曲線線性范圍內，超過線性范圍則應以流動相(5.8)稀釋樣品響應值至標準曲線響應值上限內后再進行分析。分析過程中，每20次樣品測定后應加入一個與樣品峰面積相近的標準工作溶液，如果測得的值與原值相對平均偏差超過5.0%,則應重新進行標準曲線的制作。茄尼醇標準溶液質譜圖、茄尼醇標準溶液以及典型樣品(馬鈴薯葉和2種馬鈴薯葉提取物)特征離子質量色譜圖分別見附錄A。8結果計算與表示8.1結果計算馬鈴薯葉干基樣品中茄尼醇的含量按公式(1)計算：4式中：X——試樣中茄尼醇的含量(以質量分數計),單位為毫克每克(mg/g);p——由標準工作曲線得出的茄尼醇質量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL):V——試樣最終定容體積，單位為毫升(mL);f——試樣稀釋倍數；m——試樣質量，單位為克(g);w——馬鈴薯葉中水分的質量分數。8.2結果表示測定結果以平均測定的算術平均值表示，計算結果保留兩位有效數字。兩次平行測定結果的相對平均偏差不應超過10%。9精密度和回收率本方法的精密度和回收率實驗結果參見表1和表2。表1本方法的精密度實驗研究結果(n=6)樣品名稱馬鈴薯葉馬鈴薯葉提取物1馬鈴薯葉提取液2日內相對標準偏差/%日間相對標準偏差/%4.84.7表2本方法的回收率實驗研究結果檢測參數樣品名稱取樣量/g茄尼醇含量/樣品中茄尼醇含量/mg添加水平/平均回收率/%RSD/%總茄尼醇馬鈴薯葉99.0馬鈴薯葉提取物10.10155.86×10281.7馬鈴薯葉提取物20.10061.86×10298.010檢出限該方法對茄尼醇檢出限為0.1mg/kg,定量限為0.3mg/kg。5強度強度(資料性)茄尼醇典型樣品色譜圖及質譜圖茄尼醇正離子模式質譜圖見圖A.1。茄尼醇標準溶液及典