步長腦心通對慢性腦缺血大鼠認知功能及神經細胞凋亡的影響

血管性腦癱（vd）是由多種因素引起的腦癱障礙引起的癱瘓總稱。VD患者有明顯的記憶、計算、思維、定向和判斷等能力障礙,給家庭和社會造成沉重的負擔,因此成為世界老年腦病研究的熱點和難點。目前研究認為,長期慢性腦缺血是VD形成的重要因素之一。以往本課題組的研究已證明慢性持續性腦缺血可以引起神經細胞凋亡而致進行性認知功能障礙。步長腦心通是由水蛭、地龍等組方的復方中藥制劑,傳統醫學認為其可以促進血液循環,通絡鎮痙。臨床上曾有人應用步長腦心通治療VD引起的認知功能障礙且有療效,但機制尚不清楚。本研究通過觀察步長腦心通對慢性腦缺血引起的VD大鼠神經細胞凋亡的影響,探討步長腦心通防治慢性腦缺血致VD的療效和機制,為臨床治療VD提供實驗依據。1大鼠記憶功能測定1.1動物與藥物選用雄性Wistar大鼠,鼠齡3~5月,體重300~350g,由長春市高新技術開發區醫學動物實驗研究中心提供。步長腦心通生藥粉由咸陽步長制藥有限公司提供。1.2試劑與儀器TUNEL染色試劑盒購于邁新公司,Bcl-2試劑盒購于北京鼎國公司。Morris水迷宮由中國醫學科學院治療所生產。Olympus照相顯微鏡產于日本。HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(同濟大學)。1.3動物模型制備和分組及給藥方法采用雙側頸總動脈永久結扎方法制備慢性前腦缺血大鼠模型。將造模成功的Wistar大鼠隨機分為1月和2月模型對照組(模型+鹽水)及給藥組(模型+步長腦心通),另設1月和2月正常對照組,每組6只大鼠。給藥組大鼠自手術當日起,給予步長腦心通生藥粉0.15g·d-1,溶于3mL生理鹽水1次·d-1灌胃。正常對照組和模型對照組大鼠予生理鹽水3mL·d-1灌胃。1.4記憶功能的測定采用Morris水迷宮法進行大鼠記憶功能的測定。Morris水迷宮為一不銹鋼的圓形水池,直徑130cm,高50cm。池壁標明4個入水點,由此將水池等分為4個象限,任選其中1個象限,正中放置1個直徑11cm、高29cm的平臺。所有大鼠在分組前都進行Morris水迷宮的定位航行試驗訓練:歷時4d,每天上下午各2次,將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中,記錄其在3min內尋找到并爬上平臺的時間即逃避潛伏期(escapelatency)。如果大鼠在3min內未找到平臺,則由實驗者用手牽引其至平臺上,讓大鼠停留10s,再放回籠中,以潛伏期小于180s為學會游迷宮的標準。證實各大鼠間無明顯智能差異,再進一步隨機分組制備模型。分別在術后1、2月重新進行定位航行試驗,大鼠每次在3min內尋找到并爬上平臺的時間為大鼠的記憶成績,每日2次,連續4d,計算平均成績。1.5HE和Bcl-2免疫組織化學染色各組大鼠用4%多聚甲醛灌注斷頭取腦,置于4%多聚甲醛固定24h,常規石蠟包埋,5μm厚連續切片。取相同層面切片分別HE染色和Bcl-2免疫組織化學染色。Bcl-2免疫組織化學染色采用SP法,DAB染色。在高倍鏡下觀看細胞形態和Bcl-2陽性細胞表達。用病理圖文分析系統進行圖像分析測定Bcl-2染色陽性信號的平均灰度值(灰度值與表達強度成反比)。1.6原位末端標記法(TUNEL)染色取切片分別經過氧化氫、復合消化液處理,加含末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)、地高辛標記的dUTP反應液,37℃孵育2h,連接生物素化抗地高辛抗體,DAB顯色,蘇木素復染。在高倍光鏡下,計算凋亡指數,即每張片選取5個陽性細胞數最多的高倍視野,計算出平均陽性細胞百分數并用病理圖文分析系統進行圖像分析。1.7統計分析數據均以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS10.0軟件進行統計分析,組間比較采用t檢驗。2結果2.1給藥后大鼠逃避刑期比較經過訓練已學會游迷宮的大鼠在雙側頸總動脈結扎后,1月和2月模型對照組及給藥組大鼠逃避潛伏期較正常對照組均明顯延長(P<0.01);給藥組大鼠逃避潛伏期則明顯低于模型對照組(P<0.01),見表1。2.2大鼠錐體細胞考慮1月和2月模型對照組大鼠海馬區多個神經元出現缺血性改變,且2月組大鼠錐體細胞缺血改變重于1月組,不同時期給藥組大鼠錐體細胞缺血改變明顯輕于模型組。正常對照組大2.3不同給藥組性細胞的bcl-2表達水平①凋亡細胞檢測結果:TUNEL法檢測凋亡細胞,光鏡下陽性細胞呈棕黃色,而陰性細胞呈淡藍色。結果顯示,模型對照組大鼠腦組織皮質及海馬分布大量的陽性細胞,其凋亡細胞數目明顯多于給藥組(P<0.05)(見表2)。正常對照組未見凋亡細胞(圖1A,見封二);1月模型對照組凋亡細胞較給藥組多(圖1B和C,見封二);2月模型對照組可見大量凋亡細胞,給藥組凋亡細胞較少(圖1D和E,見封二)。②Bcl-2表達水平:光鏡下觀察,Bcl-2蛋白免疫組化陽性細胞表現為在神經細胞胞漿和/或細胞膜內表達棕黃色細顆粒,陽性神經細胞胞體大,多角形,有的可見較長突起,著色深淺不一。結果顯示,給藥組大鼠Bcl-2陽性細胞灰度平均值明顯低于模型對照組(P<0.05)(見表3)。3抗凋亡作用機制VD是由于腦血管疾病引起的以學習記憶障礙為主要表現的一種疾病,病因目前尚不清楚,近年來發現慢性持續性腦血流量下降在VD發病機制中起重要的作用。本實驗應用雙側頸總動脈結扎方法制作VD模型,造成大鼠腦組織慢性持續性缺血,應用Morris水迷宮定向航行實驗證實,隨著缺血時間的延長,大鼠出現持續性認知功能障礙。本實驗通過TUNEL染色證實了慢性缺血可以引起神經細胞凋亡,且隨著缺血時間的延長大鼠出現持續性認知功能障礙,說明細胞凋亡參與慢性缺血致VD導致的認知功能障礙的過程。細胞凋亡時伴隨著一些凋亡促進或抑制基因的表達,這些基因通過對細胞凋亡發生過程的干預而對凋亡進行調控。Bcl-2是一種抑制細胞凋亡的基因,其抗凋亡的機制目前尚不清楚,Kluck等認為,Bcl-2可能是通過抑制細胞色素C從線粒體外溢,從而阻斷細胞凋亡發生。另有報道,Bcl-2可能通過減少神經元中氧化反應物質的形成、抑制鈣超載、調控細胞信號傳導等途徑而發揮抗凋亡作用。本實驗通過檢測Bcl-2的表達水平,發現Bcl-2的表達水平越高,細胞凋亡程度越輕。步長腦心通是由咸陽步長制藥有限公司研制和生產的中成藥。該藥由黃芪、丹參、當歸、川芎、紅花、乳香、沒藥、桂枝、全蝎、地龍及水蛭等組成,具有益氣活血、化瘀通絡之功效。本實驗采用步長腦心通對慢性腦缺血致VD大鼠模型進行干預,Morris水迷宮實驗結果表明,不同時間點給藥組大鼠逃避潛伏期均低于手術組,說明步長腦心通可延緩認知障礙的進行性進展。本實驗結果還顯示,給藥組大鼠較模型對照組大鼠細胞凋亡率低,同時給藥組大鼠較模型對照組大鼠Bcl-2表達增加,而1月和2月給藥組大鼠Bcl-2的表達差異無顯著性(P>0.05),說明步長腦心通可以使