第五講核酸的分子雜交與基因芯片nucleicacidhybridizationandGenechip2014.3一、核酸分子雜交的概念二、核酸分子雜交的用途三、核酸分子雜交的原理四、核酸分子雜交的過程五、影響核酸分子雜交的因素六、核酸分子雜交的基本方法七、探針的標(biāo)記八、蛋白印跡的概念及原理九、基因芯片的概念及原理十、基因芯片的種類與應(yīng)用主要內(nèi)容：第一部分核酸分子雜交1.雜交(hybridization）

從遺傳的角度來說,雜交指基因型不同的個體之間進(jìn)行的交配。遺傳學(xué)中經(jīng)典的也是常用的實(shí)驗(yàn)方法。通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個體的方法。一般情況下，把通過生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱為雜交；而把由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。一、核酸分子雜交的概念2.核酸分子雜交（nucleicacidmoleucular

hybridization）是指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。雜交的雙方分別稱為探針與待測核酸，雜交后形成的異源雙鏈分子稱為雜交分子。

DNA—DNA雜交分子DNA—RNA雜交分子DNA分子DNA分子復(fù)性RNADNA核酸分子雜交技術(shù)是目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。用途：1.是定性或定量檢測特異DNA或RNA序列片段的有力工具；2.在基因工程技術(shù)中，用放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記的寡核苷酸或cDNA探針進(jìn)行菌落雜交，可從cDNA文庫或基因組文庫中篩選出特定的克隆，獲得某一重組體；3.用克隆化的DNA片段作探針進(jìn)行Southern雜交，可確定基因組DNA上特定區(qū)域的核苷酸同源順序；二、核酸分子雜交的用途4.用S1核酸酶或RNA酶消化DNA/RNA或者RNA/RNA雜交體是分析基因轉(zhuǎn)錄或RNA加工的重要方法；5.對某一已知基因或已克隆測序的基因可利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行染色體定位；6.可用于遺傳病的基因診斷，用于限制性片段長度多態(tài)性作疾病的相關(guān)分析，基因連鎖分析，法醫(yī)學(xué)上的性別分析和親子鑒定。7.在人類學(xué)研究中也有應(yīng)用價值。核酸分子雜交的基本原理是：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及復(fù)性過程中分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是待測核酸序列和已知核酸序列。在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針（probe

），探針通常用于進(jìn)行核素或非核素示蹤標(biāo)記。三、核酸分子雜交的原理探針的意義：要檢測某一樣品或基因組DNA中特定的DNA順序或基因片段，首先必須獲得相應(yīng)的探針，即已知順序的DNA或RNA片段，并使它帶上可檢測到的示蹤標(biāo)記。ATCGGTACATTAGCCATGTA

探針序列待測樣本序列分子雜交的形式：

⑴固—液相雜交

一般在進(jìn)行某一核酸順序的檢測時，先將待測的單鏈靶核酸固定在適當(dāng)?shù)妮d體上，然后置于含相應(yīng)單鏈核酸探針的雜交反應(yīng)體系中，通過堿基互補(bǔ)配對原則，兩條單鏈的同源順序通過氫鍵互相結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。經(jīng)過對標(biāo)記探針的檢測可以判斷待檢測樣品中相應(yīng)順序的存在與否及分子量大小。

⑵液相雜交有時也將待測核酸和已知核酸同時放在液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。兩種雜交形式的基本原理都是一樣的。

1.變性：在物理或化學(xué)因素作用下，例如加熱、酸堿或紫外線照射，可以導(dǎo)致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價鍵（如磷酸二酯鍵、糖苷鍵等）則不受影響，稱為DNA變性（DNAdenaturation）。四、核酸分子雜交的過程—DNA的變性與復(fù)性導(dǎo)致DNA變性的常用方法有三種：⑴熱變性⑵堿變性⑶化學(xué)試劑變性。變性的情況：a.T<700C，DNA幾乎不變性；b.700C<T<900C，DNA部分變性；c.T>900C，DNA變性使雙鏈打開，成為單鏈分子；d.T>1000C，DNA雙鏈分離。所以，一般核酸變性的溫度都選在90～1000C之間。

（1）熱變性：當(dāng)升高核酸溶液的溫度時，核酸雙鏈間的氫鍵發(fā)生斷裂，核酸的雙鏈逐漸打開。（2）酸堿變性：當(dāng)核酸溶液的pH低于3或高于10時，核酸的雙鏈可以完全打開成為單鏈核酸分子。在分子雜交中，最常用的核酸變性方法是堿變性。因通常需要的核酸的載體如凝膠或膜對熱都不穩(wěn)定。（3）化學(xué)試劑變性：當(dāng)核酸溶液中含有一定濃度的化學(xué)試劑如尿素、甲醛等時，兩條鏈之間的氫鍵可以斷裂而形成單鏈核酸分子。除物理、化學(xué)因素外，DNA分子的組成也影響變性。最主要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易變性，而AT含量高的DNA容易變性。另外,環(huán)狀DNA比線性DNA難于變性.

DNA的變性是可逆的，即兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子在變性條件除去后重新按堿基互補(bǔ)原則以氫鍵相連形成雙鏈DNA分子，這一過程稱作DNA復(fù)性（DNArenaturation）

。如果是異源雙鏈分子的結(jié)合則稱為雜交(hybridization)

。相似的復(fù)性或雜交反應(yīng)可以發(fā)生在任何具有互補(bǔ)核苷酸順序的兩條單股核酸鏈之間，如DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段與DNA、RNA等。2.復(fù)性1.核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快；分子量越大，復(fù)性速度越慢。一般情況下：探針濃度為0.1～0.5μg；長度為50～300bp2.溫度：適宜溫度為比Tm值低250C

Tm—雙鏈DNA變性一半所需要的溫度(DNA的溶解溫度，meltingtemperature,Tm）3.離子強(qiáng)度：低離子（Na+）強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，離子強(qiáng)度增加，雜交反應(yīng)率增提高。所以，必須維持較高的雜交反應(yīng)液和洗膜液的鹽濃度五、影響核酸分子雜交的因素核酸分子雜交實(shí)際上就是兩條互補(bǔ)的單鏈核酸分子通過復(fù)性重新締合形成雙鏈的過程。這一過程受到諸多因素的影響。4.雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，從而使得：（1）在低溫下探針更穩(wěn)定；（2）能更好地保留非共價結(jié)合的核酸。一般是：50%甲酰胺35～420C5.核酸分子的復(fù)雜性：不同順序的總長度(堿基數(shù)）6.非特異性雜交反應(yīng)：

須在雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，以減少其對探針的非特異性吸附作用1.Southern印跡雜交（Southernblot）

——鑒別DNA靶分子（待測核酸是DNA）六、核酸分子雜交的基本方法3.斑點(diǎn)雜交、4.原位雜交、5.核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)等。2.Northern印跡雜交（Northernblot）

——鑒別RNA靶分子（待測核酸是RNA）根據(jù)其用途可將核酸分子雜交分為幾種基本類型：Southern印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。這是1975年英國愛丁堡大學(xué)的Southern建立的方法，因此而得名。

基本步驟：（一）Southern印跡雜交

1.待測核酸樣品的制備（1）制備待測DNA：從樣本的細(xì)胞或組織中制備DNA（2）DNA的限制酶消化：將DNA切割成大小不同的片段

2.待測DNA樣品的電泳分離：將DNA樣品在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以對DNA片段進(jìn)行分離（瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網(wǎng)狀物質(zhì)，具有分子篩的作用，DNA因其分子大小而在瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同達(dá)到分離）。

3.凝膠中核酸的變性：對凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性，使其形成較短的單鏈片段。

4.Southern轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜（NC）等固相支持物上。各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置是一樣的，故稱為印跡（blot）。（1）毛細(xì)管虹吸印跡法：利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。（見下頁圖）（2）電轉(zhuǎn)印法：通過電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上。（3）真空轉(zhuǎn)移法：其原理與毛細(xì)管虹吸印跡法相同。Southern轉(zhuǎn)膜的方法重物濕濾紙吸水紙玻璃板膠膜濕濾紙濕濾紙橋支持平臺玻璃容器20×SSC毛細(xì)管虹吸法Southern轉(zhuǎn)膜示意圖5.探針的制備：用缺口平移或隨機(jī)引物標(biāo)記的方法制備探針、標(biāo)記。7.

雜交結(jié)果的檢測（1）放射線標(biāo)記——放射自顯影，感光膠片，顯出黑色雜交帶；（2）非放射線標(biāo)記——直接顯出雜交帶，進(jìn)行檢測。6.Southern雜交（1）預(yù)雜交封閉膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)轉(zhuǎn)印后的膜在預(yù)雜交液（不含探針的雜交液）4～6小時（2）雜交（過夜）分子雜交實(shí)驗(yàn)①②③目錄放射自顯影照片目錄分子雜交電泳圖目錄Southern印跡雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

Southern印跡雜交技術(shù)已有30多年的歷史，在核酸的結(jié)構(gòu)和功能研究中作出過重要貢獻(xiàn)。如：發(fā)現(xiàn)成熟B細(xì)胞中免疫球蛋白基因重排現(xiàn)象；進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析；特定基因的定性和定量；DNA多態(tài)性(RFLP,RAPD,AFLP等)分析……

Northern印跡雜交是指將待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固—液相雜交，以檢測RNA（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本過程與Southern印跡雜交基本相同。只是在以下幾點(diǎn)有所不同。（二）Northern印跡雜交1.靶核酸——RNA2.RNA電泳——在變性膠中進(jìn)行（加入變性劑，以維持單鏈線性狀態(tài)）3.轉(zhuǎn)膜——電泳后不需要再進(jìn)行變性和中和，直接用毛細(xì)管虹吸法等方法轉(zhuǎn)移。（三）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交特點(diǎn)：簡單、快速，可在同一張膜上同時進(jìn)行多個樣品的檢測；

但不能鑒別分子量，且特異性不高，有一定比例的假陽性。將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜和尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究，稱為斑點(diǎn)印跡(dotblot)。如印跡是線狀則為狹縫印跡或狹線印跡(slotblot）（四）原位雜交核酸保持在細(xì)胞或組織樣本中，經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚砑?xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交（insituhybridization）。這是一種標(biāo)記DNA與整個染色體雜交并且發(fā)生雜交的區(qū)域可通過顯微鏡觀察的技術(shù)。特點(diǎn)：（1）不受組織成分的影響；（2）靈敏度高；（3）可完整保持細(xì)胞或組織形態(tài)，準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能；（4）可檢測多個探針。核酸原位雜交包括組織細(xì)胞的固定、預(yù)雜交、雜交、沖洗及信號檢測等基本步驟。1.組織或細(xì)胞的固定2.組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理（預(yù)雜交）3.探針的選擇和標(biāo)記4.雜交5.雜交結(jié)果檢測概念：液相雜交是指待測核酸分子與核酸探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子。種類：A.RNA酶保護(hù)分析法(RNaseprotectionassay,RPA)

用于mRNA定量、mRNA末端定位及確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置等。（五）液相雜交1.制備待測RNA;2.RNA探針的標(biāo)記3.雜交;4.除去單鏈RNA5.電泳分析B.核酸酶S1保護(hù)分析法(nucleaseS1protectionassay)

用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子剪切位點(diǎn)分析。其原理與RNA酶保護(hù)分析法類似.

1.按物質(zhì)性質(zhì)分：DNA探針和RNA探針七、探針的標(biāo)記（一）探針的種類2.按標(biāo)記物分：放射性標(biāo)記探針：32P、3H、35S

非放射性標(biāo)記探針：生物素、地高辛、熒光素1.cDNA探針：逆轉(zhuǎn)錄→cDNA→克隆于載體→擴(kuò)增重組質(zhì)粒→提取質(zhì)粒→消化重組質(zhì)粒→切割cDNA片段

→分離純化→cDNA探針cDNA探針應(yīng)用最廣泛2.基因組DNA探針：從基因組文庫→篩選特定基因（或基因片段）→克隆→擴(kuò)增→純化→切取片段→分離純化→探針3.寡核苷酸探針：一定長度的寡核苷酸片段（十幾個核苷酸以上）4.RNA探針：以RNA作為探針（基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄獲得）探針的種類1.核素標(biāo)記物一般用α-32P,但5’末端必須用γ-32P。2.非核素標(biāo)記物（1）半抗原：生物素(biotin)和地高辛(digoxin,digacin,DIG)（2）配體：生物素既是半抗原，又是親和素(avidin，

抗生物素蛋白)，故可用生物素-親和素反應(yīng)進(jìn)行雜交信號檢測（3）熒光素：異硫氰酸熒光素(FITC)（4）化學(xué)發(fā)光探針（二）標(biāo)記物1.缺口平移法(nicktranslation)(見圖)

2.隨機(jī)引物法(randonprimer)（見圖）3.PCR標(biāo)記法4.末端標(biāo)記法5.化學(xué)法（三）標(biāo)記方法缺口平移法標(biāo)記DNA探針DNaseⅠ；Mg2+5'3'

模板DNA3'5'5'3'3'

隨機(jī)打開缺口5'DNA聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs標(biāo)記的探針隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA探針5'3'模板DNA3'5'5'3'變性5'3'Klenow聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs變性標(biāo)記的探針隨機(jī)引物1.乙醇沉淀法2.SephadexG-50柱層析法3.微柱離心法（四）探針的純化

分子雜交與印跡技術(shù)在分子生物學(xué)操作上，分子雜交與印跡技術(shù)實(shí)質(zhì)上是兩個不同的技術(shù)。

分子雜交在分子生物學(xué)上一般即指核酸分子雜交。印跡技術(shù)：印跡或轉(zhuǎn)印（blot或blotting）技術(shù)是指將核酸或蛋白質(zhì)等生物大分子通過一定方式轉(zhuǎn)移并固定至尼龍膜等支持載體上的一種方法，該技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，故稱為印跡技術(shù)。

分子雜交技術(shù)與印跡技術(shù)的關(guān)系由上可以看出，分子雜交與印跡技術(shù)實(shí)質(zhì)上是兩個完全不同的技術(shù)，在很多時候，尤其是研究核酸分子的時候，兩者往往聯(lián)合使用。此時為簡便起見，通常根據(jù)研究者個人習(xí)慣或偏好將其簡稱為分子雜交技術(shù)或印跡技術(shù)。譬如，DNA的印跡技術(shù)因?yàn)橥秃怂岱肿与s交技術(shù)聯(lián)用，所以很多人也稱其為DNA印跡或DNA雜交或DNA印跡雜交技術(shù)。

Western印跡印跡技術(shù)也可以用于蛋白質(zhì)的檢測。蛋白質(zhì)在電泳分離之后也可以轉(zhuǎn)移并固定于膜上，相對應(yīng)于DNA的Southern印跡和RNA的Northern印跡，該印跡方法則被稱為Western印跡（Westernblot

或Westernblotting）。

Western印跡蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的過程與DNA和RNA的印跡技術(shù)基本類似，但也有很多不同之處，譬如WesternBlot是采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，利用免疫學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)來檢測被轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)印跡技術(shù)涉及到利用免疫學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)來檢測被轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)，故也被稱為免疫印跡技術(shù)（immuno-blotting）。Westernblot

原理：Western印跡的基本步驟1．蛋白質(zhì)樣品的制備2．蛋白質(zhì)樣品的分離3．轉(zhuǎn)印

4.檢測與結(jié)果分析Western

Blot

圖片westernblot結(jié)果：GAPDHBmi-1M123456

Bmi-1β-actinConGFPsiBmi-1si

M:MarkerⅠ;1,2:MCF-7/Bmi-1si(Bmi-1si);3,4:MCF-7/GFPsi(GFPsi);5,6:MCF-7(con)博士論文答辯

印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

三種印跡技術(shù)的比較

重點(diǎn)掌握：一、核酸分子雜交的概念二、原理三、種類：1.Southern印跡雜交

四、探針的種類：1.cDNA探針；2.基因組DNA探針；3.寡核苷酸探針；4.RNA探針五、標(biāo)記的方法：1.缺口平移法；2.隨機(jī)引物法；3.PCR標(biāo)記法；2.Northern印跡雜交3.斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交4.原位雜交5.液相雜交4.末端標(biāo)記法

六、Western印跡的概念及原理基因芯片

Genechip

第二部分內(nèi)容提要什么是基因芯片基因芯片的原理基因芯片的種類基因芯片的應(yīng)用領(lǐng)域基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析基因芯片技術(shù)的發(fā)展與展望一、概述基因芯片（Genechip）也叫DNA芯片（DNAchip）是指在固相載體（玻璃、硅等）上有序地、高密度地（點(diǎn)間距<500

m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探針）。這些被固定的分子探針在基質(zhì)上形成高密度的DNA微陣列，因此，DNA芯片又叫DNA微矩陣（DNAMicroarray）。第一塊基因芯片1992年誕生在美國。基因芯片掃描結(jié)果圖DNA芯片屬于生物芯片（biochip）的范疇，生物芯片包括：1.基因（DNA）芯片2.RNA芯片3.蛋白質(zhì)芯片4.抗體芯片5.細(xì)胞芯片6.組織芯片7.其它芯片（元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片、樣品制備芯片、核酸擴(kuò)增芯片、毛細(xì)管電泳芯片等）二、DNA芯片的基本原理1.基因芯片技術(shù)是建立在Southernblot基礎(chǔ)之上的，可以說它是Southernblot的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變性DNA加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。2.基因芯片與Southernblot的比較基因芯片的基本原理與Southernblot技術(shù)一脈相承，點(diǎn)樣技術(shù)和數(shù)據(jù)讀取技術(shù)的發(fā)展是基因芯片技術(shù)對傳統(tǒng)核酸雜交的技術(shù)性突破，因此，基因芯片技術(shù)是基因功能研究領(lǐng)域的一次革命，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中新近出現(xiàn)的一項(xiàng)嶄新技術(shù)。通過基因芯片人們可以大規(guī)模、高通量（海量）地對成千上萬個基因進(jìn)行同時研究，可以說給整個生命科學(xué)都將帶來深刻的影響。與Southernblot相比較，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自動化的特點(diǎn)。GeneChip?:SynthesizingOrderedOligonucleotideArrays3.基因芯片基本操作流程制備總RNA→mRNA經(jīng)RT-PCR用Cy3（正常對照組）和Cy5（實(shí)驗(yàn)組）熒光標(biāo)記目的基因，得到cDNA探針→混合標(biāo)記探針→與表達(dá)譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交→掃描→分析雜交結(jié)果→結(jié)論載體+寡核苷酸-探針分子+熒光染料-點(diǎn)樣儀-掃描儀-計算機(jī)+專業(yè)軟件三、DNA芯片的種類表達(dá)譜芯片診斷芯片檢測芯片