基因工程研究策略基因決定性狀青霉素能產(chǎn)生青霉菌家蠶能吐出蠶絲為人類利用定向改造基因的設(shè)想1.能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？2.能否讓微生物產(chǎn)生人胰島素、干擾素等昂貴藥物？經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物DNA的技術(shù)-基因工程基因工程過程示意圖①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③提取大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達③③基因工程的研究策略一、目的基因的分離(donorDNA)二、載體DNA及其改造(VectorDNA)三、體外DNA重組(DNArecombination)四、重組DNA的轉(zhuǎn)化(Transformation)五、重組體的篩選鑒定與克隆擴增

(identification&cloneamplification)六、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(geneexpression)一、目的基因的分離從cDNA文庫中分離目的基因從基因組DNA文庫中分離目的基因PCR擴增目的基因片段化學(xué)方法人工合成基因cDNA文庫僅包含正在表達的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.從基因組DNA文庫獲取目的基因包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況4.化學(xué)合成法獲取較短的目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列二、載體DNA載體

(Vector)載體是目的基因的運載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴增和表達。常用載體

質(zhì)粒病毒載體噬菌體

粘性質(zhì)粒/粘粒

載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)有復(fù)制起點，能自主復(fù)制；具有篩選標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其復(fù)制功能；分子量小，以容納較大的外源DNA。表達型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。穿梭載體(shuttIevector)

又稱雙功能載體(bifunctionalvector)。能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體。其可同時具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點和真核生物可識別的病毒復(fù)制原點或酵母菌的自主復(fù)制序列（ARS），它即能在原核細(xì)胞中擴增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達。主要用于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細(xì)菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達，并可提高外源基因的表達效率。如pKSV一10、pJDB219載體等。載體的分類-按來源分

質(zhì)粒(plasmidvector)病毒(virusvector)噬菌體(phagevector)粘性質(zhì)粒/粘粒(cosmidvector)

1.質(zhì)粒載體:

(1)分子量較小，在細(xì)菌中有較多的拷貝數(shù)。(2)松馳型。

(3)具有一個以上的標(biāo)志，便于篩選。(4)具有數(shù)個或一個單一的酶切點。

天然的質(zhì)粒不能具備以上所有條件，所以實際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322,pUC19.，2．病毒載體（1）整合型載體：外源基因通過這種病毒載體與宿主細(xì)胞的染色體整合，外源基因隨宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴增。（2）游離型載體：能夠以病毒顆粒的形式在宿主內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進行復(fù)制。如：腺病毒。3.λ噬菌體載體

現(xiàn)用的λ噬菌體載體都是在野生型基礎(chǔ)上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：①插入型載體，具有一個可供外源DNA插入的克隆位點，只能插入較小的外源DNA片段(＜10kb)。如λgt10、λgt11；②替換型載體，具有成對的克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區(qū)段可被外源插入的DNA片段取代，能插入較大的外源DNA片段(20-24kb左右)。如charon4、charon10。4.

Cosmid質(zhì)粒

由λDNAcos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進行復(fù)制，但不表達噬菌體的任何功能。

分子量小（約4—6kb），可容納大至40-50kb的外源DNA片段。適用于構(gòu)建真核細(xì)胞的基因文庫。

如cosmidpHC79限制性內(nèi)切酶―“分子剪刀”Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，能專一地識別DNA分子上特定的堿基序列并將DNA切斷的內(nèi)切酶。識別序列的特點；(I)專一；(2)常由4–6個堿基組成；(3)具有回文序列經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端。可以產(chǎn)生相同粘性末端的不同的限制酶稱作同尾酶。BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體2.平齊末端連接優(yōu)點：可連接任何一對DNA可恢復(fù)一個酶切位點或產(chǎn)生一個新酶切位點缺點：連接率低要求連接酶及底物濃度高GAAＴＴＣＣＴＴＡＡＧGAAＴＴＣ

3.同聚物核苷酸末端法

在DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶在DNA片段3′末端制備粘末端。避免自身環(huán)化互補序列較長時（>4bp)，不需連接酶

4.T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中增加延伸時間，Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)四、重組DNA的轉(zhuǎn)化1.基本概念轉(zhuǎn)化（transformation）：把以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）：以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組DNA引入受體細(xì)胞的過程。感染（infection）：病毒或重組病毒DNA進入細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化子：又稱工程菌，即接受了重組DNA的受體菌。2.受體細(xì)胞感受態(tài)感受態(tài)(competent)

：細(xì)胞最易攝取和“容忍”外來DNA的生理狀態(tài)。致敏：誘導(dǎo)細(xì)胞進入感受態(tài)的操作。３．轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞常用的方法

1.磷酸鈣共沉淀法；2.DEAE-葡聚糖或聚陽離子促進吸收法；3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法；4.電穿孔法；5.病毒轉(zhuǎn)染法；6.顯微注射法。

五、重組體篩選、鑒定與克隆擴增平板篩選插入失活插入表達電泳篩選PCR篩選核酸雜交DNA測序免疫學(xué)檢測法1.常用篩選/鑒定陽性重組體的方法初步篩選精確鑒定表型鑒定1.平板篩選法（1）插入失活（insertionalinactivation)：

在載體某個基因序列的限制性內(nèi)切酶位點上插入外源DNA后，使該基因失去活性，從而不能表達其相應(yīng)的功能。常以此現(xiàn)象作為標(biāo)記，篩選被這種重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇1.

Amps

Tets

（轉(zhuǎn)化失敗）2.

Ampr

Tetr（轉(zhuǎn)化成功，但僅轉(zhuǎn)入載體，無重組）3.Ampr

Tets

（轉(zhuǎn)化、重組均成功）（2）插入表達（insertionalexpression)載體設(shè)計時，在篩選標(biāo)志基因前連接一段負(fù)調(diào)控序列（抑制作用），當(dāng)目的基因在此插入時，使其對下游的抑制作用喪失，從而下游的篩選標(biāo)志得到表達。CI為負(fù)控制序列（抑制Ter表達）當(dāng)DNA插入使CI失活Ter表達，由此作為陽性克隆的篩選。

2.酶切-電泳法篩選

經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后再抽提出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA,用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，電泳后根據(jù)DNA分子大小不同，鑒別真正重組體DNA，排除假陽性和載體自我連接載體雙重體。

該法不能鑒別插入片段大小相似的非目的基因片段的假陽性。

聯(lián)合酶切鑒定同源末端連接重組子中DNA插入片段的方向ＢＢ3.PCR法篩選

提取重組質(zhì)粒DNA，用已知的特異引物擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測有無相應(yīng)電泳帶。4.核酸分子雜交（hybridization）兩條不同來源的含有互補核苷酸序列的單鏈核酸分子，通過堿基配對規(guī)律形成一個新的穩(wěn)定的雙鏈核酸分子的過程菌落原位雜交（HybridizationinSitu）（以細(xì)菌為受體細(xì)胞）使用與目的DNA互補的探針鑒別陽性轉(zhuǎn)化菌菌落原位雜交法篩選復(fù)印至硝酸纖維素膜上用NaOH菌體裂解DNA變性雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點細(xì)菌菌落單鏈DNA結(jié)合到膜上5.DNA測序測序：確定DNA鏈上確切的堿基順序方法：對初步篩選的陽性重組子，擴增后抽提質(zhì)粒，酶切回收片斷，進行DNA測序確認(rèn)。

6.免疫學(xué)檢測法鑒定表達產(chǎn)物

依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的原理，以單克隆抗體對表達產(chǎn)物進行特異性檢測。六、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達基因工程表達系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)基因工程操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體基因工程的實踐1.利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗

乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能生長，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但其大規(guī)模生產(chǎn)受到病毒表面抗原來源的限制，而且提取物需要高度純化，純化過程中往往會發(fā)生失活現(xiàn)象。此外，最終產(chǎn)品還必須嚴(yán)格檢驗其中是否混有病人的致病病毒。所有這些工序?qū)е轮圃斐杀靖呔硬幌拢虼诉@種傳統(tǒng)的乙肝疫苗生產(chǎn)方法不能滿足幾億接種人群的需求。乙醇氧化酶基因(aox1)啟動子可幫助該質(zhì)粒整合到特定染色體位點的序列(3’-aox1)His合成過程中所需的組氨醇脫氫酶基因(his)圖10-12宿主采用組氨醇脫氫酶缺陷型(HIS4－)的P.pastoris，經(jīng)雙交換整合重組后，染色體上的aoxl丟失，而整合入aoxl啟動子—HBsAg-aoxl終止子及加poly(A)信號序列、his4和3'aox1。整合后的細(xì)胞可在不含His的培養(yǎng)基上生長在酵母細(xì)胞中，這種蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人體細(xì)胞中那樣，組裝成多亞基的復(fù)合物，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗