四大家魚微衛星標記的篩選及其在物種鑒定中的應用摘要采用132對微衛星(SSR)引物分別對四大家魚基因組DNA進行PCR擴增篩選,共獲得12個特異性標記可作為四大家魚的鑒定位點,其中青魚6個(HL13、BL12、Q3214、Q3191-1、hljy2526、Q3205)草魚3個(Q3205、C3210、C41926)鰱魚3個(hljy2526、L718-2、L30814)鳙魚2個(Y11534、Y666)。用這些微衛星標記對2006年肇慶江段5-6月份采集的漂流性仔稚魚（酒精保存樣本）進行四大家魚的識別，結果表明四大家魚在5、8月份所占的比例最大分別11.81%和22.8%，9月份次之,6、7月份比較少；在總量上，草魚最多，青魚最少，鑒定結果與形態鑒定基本一致，說明采用微衛星標記進行種類鑒定是可行的。青魚、草魚、鰱魚和鳙魚原是我國特有的魚類，最早作為馴養種類故有“四大家魚”之稱。四大家魚在我國具有分布廣、生長快、食性廣、抗病力強、肉味鮮、易養殖等特點，是我國淡水養殖和捕撈的主要對象。近年來，由于水利工程建設、環境污染、過度捕撈等諸多因素，使四大家魚的天然產量急劇下降，四大家魚的資源狀況直接影響著我國淡水漁業的持續發。為此，有必要對四大家魚的早期資源展開調查。

對四大家魚早期資源進行調查，種類鑒定是最基礎也是最關鍵的一步，但是仔魚標本經甲醛或酒精固定后，可能會變色或褪色，因此使仔魚種類鑒定受到很大的限制，再加上人為因素的影響，會給鑒定結果帶來偏差。微衛星標記具有多態性高、簡單的孟德爾遺傳方式、共顯性等位基因等優點，是解決上述問題的有效方法。Morgan等在貝類的鑒定中,利用位點在不同物種中擴增條帶的不同從而將貽貝從其他物種中區分出來,宋紅梅等利用77對微衛星引物對奧利亞、尼羅和橙色莫桑比克3種羅非魚基因組DNA進行PCR擴增，篩選出17個微衛星鑒定位點，從而將這3種羅非魚區分開來。本文通過獲得四大家魚的特異性微衛星標記，重在建立四大家魚的分子識別技術，并將其應用到仔稚魚的鑒定中，從而獲得四大家魚在西江肇慶江段的種群組成與時空的變化關系，為四大家魚資源狀況評估及漁業管理提供科學依據，對把握漁業資源數量變動具有重要的意義。1、材料與方法1.1、試驗材料青魚60尾：養殖群體30尾采自桂江增殖放流樣本，野生群體各,15尾分別采自西江梧州及北江西牛鎮；草魚96尾：養殖群體36尾采自賀江南豐，野生群體各20尾分別采自西江桂平、梧州及北江西牛鎮；鰱魚80尾：養殖群體20尾采自廣東順德，野生群體各,30尾分別采自西江梧州及北江清遠；鳙魚70尾養殖群體20尾采自廣東順德，野生群體各25尾分別采自西江梧州及北江清遠。上述樣品均于2009年11月采集，均為-20℃無水乙醇固定的鰭條。

魚苗：于2006年用定置網具在肇慶江段定點采集的漂流性仔魚樣本，經乙醇固定后置于室溫避光保存。1.2、試驗方法1.2.1基因組的提取

采用傳統的酚氯仿法，稍作修改，提取四大家魚的鰭條基因組DNA，用紫外分光度計檢測DNA樣品的濃度和純度，用ddH2O將DNA稀釋至50ng/μL，置于-20℃保存備用。魚苗的消化將試驗魚苗用緩慢漂洗次然后將整尾魚苗置于的溶中水浴消化裂解完畢后加入體積的渦旋混勻離心取上清作為反應的模板室溫靜置保存微衛星引物的獲取與合成從和下載有關四大家魚的或序列經搜索獲得草魚條包含的序列鰱魚包含的序列再經程序比對去重復序列選取其中一部分序列采用軟件設引物對并從文獻中下載有關四大家魚的引對引物均由廣州英俊生物公司合成擴增及電泳檢測反應體系為上下游引物各聚合酶模板反應程序為預變性變性退火延伸個循環延伸擴增產物在的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測電泳后銀染及顯色微衛星位點的初步篩選及擴大群體的確定以青魚草魚鰱魚鳙魚各尾包括野生群體和養殖群體的基因組為模板進行微衛星引物篩選先篩選四大家魚特異的單態性標記擴增效果重復性好帶型清晰明亮的引物并進一步擴大群體初步確定鑒定四大家魚的微衛星位點考慮到微衛星引物的通用性然后再根據肇慶江段同期形態學鑒定結果中出現的種類對所作的標記加以驗證最終選擇在其他魚類中沒有任何擴增產物的標記作為鑒定標記仔魚待檢樣本的抽取與統計分析魚苗總數的計算將整瓶魚苗標本從酒精中取出去掉雜質及形態上可識別的較大個體用濾紙吸干表面的乙醇稱其總重并計作隨機選取適量樣本記作稱重并記為然后按照下列公式計算魚苗總數抽取的仔魚樣本以尾為單位分別提取樣本作為微衛星鑒別用模板根據每個個體產生條帶位置確定基因型利用軟件分析微衛星條帶大小結果與分析微衛星位點的初步篩選及擴增本試驗用對微衛星引物對四大家魚個個體基因組進行擴增去掉多態性標記和在四大家魚中擴增產物一致的單態性標記初步篩選到個特異性標記可作為四大家魚的鑒定位點其中青魚個草魚個鰱魚個鳙魚個大小分別為通過對其擴大群進行驗證青魚除個位點具有多態性外其余種類均為單態性標記用肇慶江段同期形態學鑒定結果中出現的種類對剩下的個標記進一步驗證結果顯示在其他魚類中沒有任何擴增產物可作為鑒定用標記即可以將四大家魚完全區分開具體信息見表由于微衛星引物具有通用性位點可同時作為青魚和鰱魚的鑒定位點位點可同時作為青魚和草魚的鑒定位點這極大地提高了試驗效率而且對所做的標記起到相互驗證的作用這些位點的部分擴增結果見圖圖魚苗鑒定結果選取上述所作的標記組合進行魚苗中四大家魚的鑒定為提高試驗效率盡量選取能將不同種類區分開的單個位點進行微衛星標記如位點先對其中兩種魚進行識別剩余兩種則隨機選取相對應的兩個鑒定位點鑒定結果見表和圖從表和圖可以看出四大家魚占總數的其中鰱魚所占的比例最大為其次是草魚鳙魚青魚所占的比例最小為結果與形態鑒定圖結果基本一致不同的是形態鑒定中草魚占優勢而本研究鑒定結果是鰱魚占優勢結論與討論四大家魚特異性微衛星位點的獲取微衛星標記的篩選和開發是利用微衛星標記鑒定物種中最關鍵的一步本研究從經濟省時高效的目的出發從已發表的文獻和數據庫中查找微衛星標記其中從文獻中共獲得個微衛星位點其中個位點和可用于四大家魚的種類鑒定說明從文獻中獲取微衛星標記是可行的但是獲取效率較低可能與這些標記用于四大家魚遺傳多樣性的研究有關多態性較高不利于單態性標記的篩選是近年來開發微衛星標記的首選數據庫研究表明中含有較為豐富的微衛星序列約有個別物種甚至達到以上本文從和中獲得個微衛星標記共篩選出四大家魚的個微衛星鑒定位點篩選效率較從文獻中獲取較高認為重復次數多的微衛星既能在種間又能在種內產生多態性但重復次數少的微衛星僅能在種間產生多態性可能與本文所篩選的標記中重復次數較少有關四大家魚種類鑒定選取上述標記組合在采集的未知漂流性仔魚中進行四大家魚的識別結果表明四大家魚占樣本中漂流性仔魚總數的主要出現在月月份比較少四大家魚中鰱魚所占的比例最大為其次是草魚鳙魚青魚所占的比例最小為于年對珠江魚類仔稚魚的調查結果表明四大家魚占全年漂流性仔魚總數的本試驗只在