1、關于兔瘟組織滅活苗的制作第1頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四流行病學診斷 臨床診斷 病理診斷第2頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 微生物(Microorganism) 形體微小、結構簡單，須借助于光學顯微鏡或電子顯微鏡進行觀察。 病毒(包括噬菌體)； 細菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體等； 真菌：包括酵母菌（單細胞）、霉菌（多細胞）； 單細胞的藻類以及原生動物等。非細胞型微生物單細胞原核微生物真核微生物第3頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 細菌(bacteria)的細胞形態 1、球菌 單獨存在時為圓球形，幾個

2、細菌聯在一起時其接觸面稍為扁平。按其分裂方向和分裂后排列狀態，可以分為：單球菌、雙球菌、四聯球菌、八疊球菌、鏈球菌、葡萄球菌。2、桿菌 細胞呈桿狀或圓柱狀，各種桿菌的長度與直徑比例差異很大，有的粗短，有的細長，短桿菌近似球狀，長桿菌近似絲狀。一般來說，同一種桿菌其粗細比較穩定，而長度則經常因培養時間、培養條件不同而有較大變化。有的桿菌很直，有的稍彎，有的兩端截平如炭疽芽孢桿菌，有的略尖，有的半圓。 第4頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 （三）革蘭氏染色 革蘭氏染色法于1884年由丹麥醫生Gram創立，是延用至今的經典染色法。 經革蘭氏染色后可以把全部細菌分為G+和G-兩

3、大類。 染色機制：與細菌細胞壁的結構和組成有很大關系。 G+細菌：肽聚糖層厚，含量多，經乙醇處理后使之發生脫水作用而使孔徑縮小，結晶紫與碘的復合物保留在細胞內而不被脫色，復染后不著色，保持結晶紫的顏色； G-細菌：肽聚糖層很薄，含量少，脂肪含量高，經乙醇處理后部分細胞壁脂類可能被溶解并改變其組織狀態，細胞壁孔徑變大或通透性增加，不能阻止溶劑透入，酒精將結晶紫與碘的復合物洗脫，細菌被脫色，經復染后染成紅色。 第5頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四細胞壁革蘭氏陽性菌 (G+)革蘭氏陰性菌 (G-)厚度與強度厚、致密、堅韌薄、疏松肽聚糖數量、含量多層、含量高、占細胞干重4090

4、%單層、含量低、占細胞干重510%脂類含量少、占細胞干重1-4%多、占細胞干重11-22%磷壁酸（垣酸）+-脂多糖、磷脂、脂蛋白-+肽聚糖脂蛋白磷壁酸外膜第6頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四染色操作步驟涂片固定滴生理鹽水挑取菌苔一環涂片熱固定干燥取菌液一環涂片干燥第7頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四革蘭氏染色法1. 涂片、干燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1-2分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4. 脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約25秒

5、，后立即用流水沖洗。5. 復染：滴加番紅染色液，染2分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 6. 鏡檢：觀察染色結果圖。第8頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四細水沖洗結晶紫初染2min碘液媒染1min95%酒精脫色 20s蕃紅復染 12min細水沖洗細水沖洗第9頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 革蘭氏染色成敗關鍵： 酒精脫色，脫色不夠將G-轉變為G+，脫色過度將G+變成G-； 涂片要均勻、?。?菌齡影響染色，菌齡老、陳舊的細菌培養物，往往G+轉變成G-，一般做革蘭氏染色用18小時左右的細菌培養物，不要超過24小時，以免影響染色性。第10頁，共28頁，2022年

6、，5月20日，9點52分，星期四油鏡操作規程1. 先用低倍鏡和高倍鏡觀察涂片，待看到目的物后，將其移到視野中央。2. 在涂片上滴一滴香柏油，轉動換轉器使油鏡針對通光孔。3. 使油鏡與香柏油接觸，這時油鏡頭幾乎與載玻片相接觸，切記不能使用粗調，以免壓碎載玻片。4. 用細調旋鈕慢慢提升鏡頭高度，直至物像清晰。切勿擰反方向。5. 觀察完畢后，使鏡筒遠離載物臺。取下載玻片。用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油：先用干的擦鏡紙擦12次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦2次，最后再用干擦鏡紙擦1次。擦拭時要順鏡頭的直徑方向，不要沿鏡頭的圓周擦。擦拭要細心，動作要輕 。 第11頁，共28頁，2022年，5月2

7、0日，9點52分，星期四五、結果： 繪模式種、自選種鏡檢油鏡視野圖（比例、形狀準確，注放大倍數，染色特性）G+ (金黃色葡萄球菌)G-（枯草芽孢桿菌）G-（大腸桿菌）第12頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四Gram Stain of Staphylococcus aureusGram Stain of Escherichia coliA Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.第13頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 兔病毒性出血癥的診斷及其組織滅活苗的制

8、造王海榮第14頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 兔的病毒性出血癥（rabbit viral hemorrhagic diseaze）是兔的一種急性敗血性傳染病，RHDV抗原性強，組織滅活苗效果極佳，安全可靠，目前廣泛使用的是肝組織甲醛滅活苗，聯苗兔瘟、巴氏桿菌二聯苗也已使用。第15頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 組織滅活苗可分加佐劑和不加佐劑兩種。含佐劑苗所產生的抗體水平較高于無佐劑苗，但產生免疫力的時間遲于無佐劑苗，而且生產程序較為復雜，成本也高。 當發生免瘟時，作為緊急接種，選用無佐劑苗更為理想，因產生免疫力較快，可提早控制疫情，即使平時預

9、防接種，無佐劑苗也極為有效。第16頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四一 材料 （1）種毒 強毒株組織毒1:10懸液感染成兔肌注1ml，4872小時引起發病死亡。（2）制苗動物 3月齡以上未感染本病和未接種本病疫苗的健康免。 組織搗碎機等第17頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四二、操作方法1、攻毒取種毒2-5g制成1:10組織懸液，每毫升各加青鏈霉素1000IU單位,在4處理46小時，取上清液皮下或肌肉注射兔子，1ml/只，實驗免接毒后的觀察。第18頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四（1）抗生素可先配制成高濃度的原液， -20保存

10、。（2）抗生素的最高使用濃度。 青霉素鉀1萬單位/ml 鏈霉毒鉀：20mg/ml即 1mg=1000Iu 2萬Iu/ml。 抗生素的配置： 1先配濃溶液20萬/ml，25萬/ml第19頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四2、RHD的臨床診斷及實驗室診斷臨床上，RHD以神經癥狀為主，在免疫壓力可表現出非典型變化。剖檢以呼吸系統的嚴重出血和內臟實質器官的淤血腫大為特征。人工感染后的發病高峰時間 接種后3672小時。第20頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四RHDV可凝集人的O型紅細胞，溫度對血凝無顯著影響，PH4.4-7.2時血凝穩定，血凝具有特異性，能被高

11、免血清所抑制。 第21頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四 10%肝懸液4000rpm，10-15分鐘離心后取上清，1%人O型紅細胞做HA，放置20-30分鐘出結果，血凝現象的觀察時間不超過45分鐘。 HA1160即為陽性 陽性病料無論是自然死亡還是人工感染致死，其血凝價一般不低于25。 健康兔只有2223，24。第22頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四RHD組織滅活苗的制造與檢驗 病料：PBS=1:10，生理鹽水也可。搗碎、濾過，加入甲醛，使之含0.4%，371224小時，搖勻/2小時。 用0.8%甲醛生理鹽水對倍稀釋，分裝，37溫箱內滅活48小時，每2小時搖勻一次，備檢。第23頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四方 法： 100g+400ml滅菌生理鹽水高 速組織、搗碎碎機勻漿（13）過濾用0.8%甲醛生理鹽水對倍稀釋分裝37溫箱內滅活24小時，每2小時搖勻一次，備檢。第24頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分，星期四檢驗： 安全檢驗：23倍接種量1ml3ml(血液瓊脂斜面，厭氧肉肝湯) 無菌檢驗：培養基接種。 效力檢驗：第25頁，共28頁，2022年，5月20日，9點52分