1、化學發光磁酶免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體答辯人： 楊璐 導 師： 崔亞麗 教授 李如琳 副教授 西北大學 Contents1. 背景介紹3. 全文總結2. 實驗部分梅毒 梅毒螺旋體 嚴重性傳播疾病 發病率不斷上升 2010年4月國家衛生部全國法定 傳染病疫情報告： 全國乙類法定傳染病發病第位梅毒檢測：孕前檢查 供血者血液常規篩選檢查西北大學 醫院常用梅毒螺旋體免疫學檢測方法快速血漿反應素環狀卡片實驗試驗（RPR）和甲苯胺紅試驗(TRUST) 初篩 假陽性高 判斷主觀梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA）和梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA） 確認 判斷主觀 操作繁瑣 要求嚴格梅毒ELISA實驗 靈敏

2、度有待進一步提高 西北大學 化學發光免疫分析技術免疫分析系統化學發光分析系統（抗原、抗體，免疫反應）免疫分析高特異性及化學發光高靈敏度于一體（酶的化學發光底物或氧化劑）西北大學 梅毒螺旋體抗體化學發光法檢測 靈敏度極高 自動化化學發光法檢測梅毒的商品化試劑盒國外： Abbott：ARCHITECT Syphilis TP 磁粒 國內： 北京科美東雅生物技術有限公司：梅毒螺旋體抗體化學發光試劑盒 酶標板西北大學 聚乙烯酶標板板表面包被面積有限反應空間有限靈敏度受限化學發光固相載體的選擇磁性微粒比表面積大分散性好易分離靈敏度更高西北大學 包被反應檢測實驗原理西北大學 第一部分 方法的優化1HRP標

3、記抗原稀釋液的確定2包被抗原最佳用量及酶標抗原最佳工作濃度的確定3樣本稀釋液的確定4保護劑的選擇西北大學 HRP標記抗原稀釋液的確定a PBST+20%小牛血清b PBST+0.1%BSAc PBST+0.5%BSAd PBST+1%BSAe PBST+1.5%BSA降低非特異性吸附 ： 加入非特異性蛋白與表面活性劑陰性樣本的發光值西北大學 樣本稀釋液的確定陽性血清稀釋倍數檢測結果1PBS生理鹽水PBS+0.1%BSA 正常人血清1:25+1:50+1:100+1:200+1:400+1:800+1:1600+1:3200+1:6400+ -+ -+1:12800-+1:25600-+ -+

4、-1:51200-最佳樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA檢測靈敏度與正常人血清相當西北大學 保護劑的選擇保護劑X對HRP標記抗原的保護作用良好HRP標記抗原置于37、放置6天西北大學 保護劑Proclin300與保護劑X的對比實驗選定濃度為0.05%的Proclin300作為保護劑西北大學 保護劑Proclin300對HRP標記抗原的保護作用含0.05%Proclin300的 HRP標記抗原置于37、放置6天西北大學 第一部分實驗小結 在初步建立的化學發光檢測梅毒螺旋體抗體方法的基礎上進一步優化，確定各最佳工作條件如下：1. HRP標記抗原稀釋液：PBST+1% BSA作為HRP 標記抗原稀釋

5、液；2. 抗原包被量：210 ng/孔(7 g/mg )；3. 酶標抗原稀釋濃度：1: 3000時，發光強度達到最佳；4. 血清樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA；5. 保護劑：濃度為0.05%Proclin300的PBS緩沖液。西北大學 4參考值6對比實驗1穩定性3標準曲線25精密度特異性第二部分 實驗方法的評價西北大學 穩定性化學發光試劑分別置于4冰箱和37生化培養箱中放置6天將陽性血清分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍后進行檢測西北大學 精密度國家標準（15%） 批內差： 2.86%5%次數檢測結果陽性檢測平均值RSD（%）1PN542315573523624915605715

6、574715594923586052P N59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大學 質控標準品10次重復測定結果質控品：抗-TP標準物質（2NCU/mL）相對標準偏差：5.42%西北大學 標準曲線將梅毒螺旋體抗體質控標準品（4 NCU/mL）梯度稀釋，在0.25

7、 4 NCU/mL范圍內線性良好Y = 599.1X-165.9R2 = 0.9980西北大學 特異性陰性符合率均為100% 80例臨床血清樣本 20例乙肝陽性血清 樣本（TP陰性） 20例丙肝陽性血清 樣本（TP陰性）本次實驗：COV=N2.1=54.6發光值西北大學 乙肝陽性樣本檢測結果丙肝陽性樣本檢測結果COV=54.6COV=54.6發光值發光值乙肝血清樣本丙肝血清樣本陰性符合率均為100%西北大學 化學發光磁酶免疫分析法與商品化化學發光試劑盒對比靈敏度比商品化化學發光試劑盒提高4倍陽性血清稀釋倍數檢測結果商品化試劑盒化學發光磁酶免法(MECLIA)1:100+1:200+1:400+

8、1:800+1:1600+1:3200+1:6400-+1:12800-+1:25600-+ -1:51200-西北大學 化學發光磁酶免法（COV=N2.1=53.2）商品化化學發光試劑盒COV=N2.1=26151）特異性對比實驗：二者相當，陰性符合率均100%發光值發光值20例陰性血清樣本20陰性血清樣本COV=53.2COV=26151西北大學 西北大學 第二部分實驗小結國家法規：體外診斷試劑注冊管理辦法分析性能評估資料：分析靈敏度、分析特異性、檢測范圍 批內不精密度、批間不精密度等項目參考值（參考范圍）確定穩定性研究資料發光免疫分析試劑生產及質量控制技術指導原則 根據各個試劑盒的企業標

9、準或者制檢規程進行檢驗，檢驗指標一般包括準確性、靈敏度、特異性、精密性（批內差）、相關性等，均應達到相應的質量標準。穩定性：4，及37加速破壞性實驗，均顯示保存穩定性良好；精密度： 批內差在2.865%，批間差在5.19.7%，對質控品重復 10 次檢測，變異系數為5.42%，均達到國家標準（ 15%）方法評價結果西北大學 標準曲線：在0.25 4 NCU/mL范圍內線性范圍良好臨界值：臨界值為陰性對照血清均值的2.1倍特異性：檢測臨床TP抗體陰性血清，陰性符合率為100%，特異性良好對比實驗：靈敏度較商品化化學發光試劑盒提高4倍，特異性二者相當西北大學 穩定性 精密度線性范圍 參考值特異性

10、對比實驗HRP標記抗原稀釋液抗原包被量酶標抗原稀釋濃度血清樣本稀釋液保護劑對方法進行比較全面的評價方法的進一步優化初步建立的化學發光磁酶免疫分析法全文總結：西北大學 試劑盒研制成功中試放大梅毒抗體臨床科研血清盤梅毒螺旋體抗體診斷試劑國家參考品臨床試驗西北大學 主要生產工藝及反應體系研究資料 半成品試劑盒的檢定成品試劑盒的檢定 Company Logo 包被抗原酶標抗原試劑盒陽性對照品、陰性對照品研制Company Logo主要原材料研究資料穩定性研究資料批間穩定性標準品穩定性檢測試劑盒成品穩定性檢測試劑盒開封穩定性Company Logo性能評估資料試劑靈敏度的考察試劑特異性的考察試劑重復性的考察試劑準確性的考察 與市售同類產品的比較Compan