1、靜態生物化學復習蛋白質結構與功能氨基酸結構與名稱縮寫肽鍵結構蛋白質分子結構協同與變構效應蛋白質的理化性質蛋白質分離純化非極性疏水性氨基酸極性中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸氨基酸的分類2. 極性中性氨基酸3. 酸性氨基酸4. 堿性氨基酸* 肽鍵(peptide bond)：是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。肽(peptide)肽鍵平面蛋白質的分子結構基本結構空間結構一級結構二級結構三級結構四級結構蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象 。定義：穩定因素： 氫鍵 -螺旋結構要點: 多

2、肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。 每圈螺旋含3.6個氨基酸，螺距為0.54nm。 每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩定。氫鍵與螺旋長軸基本平行。-折疊多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結構，側鏈位于鋸齒結構的上下方。 兩段以上的 -折疊結構平行排列 ，兩鏈間可順向平行，也可反向平行 。兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩固 -折疊結構。氫鍵與螺旋長軸垂直。 -轉角和無規卷曲-轉角：無規卷曲：沒有確定規律性的肽鏈結構。 肽鏈內形成180回折。含4個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。 第二個氨基酸殘基常為Pro。模體蛋白質分子中，二個或三個具有

3、二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個具有特殊功能的空間構象，被稱為模體(motif)。影響二級結構形成的因素氨基酸側鏈所帶電荷 、大小及形狀。影響-螺旋形成的因素： -折疊形成條件：要求氨基酸側鏈較小。纖連蛋白分子的結構域 結構域 (domain) 大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數個球狀或纖維狀的區域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結構域。亞基之間的結合力主要是氫鍵和離子鍵。蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。每條具有完整三級結構的多肽鏈，稱為亞基 (subunit)。變構效應(allosteric effect)凡

4、蛋白質（或亞基）因與某小分子物質相互作用而發生構象變化，導致蛋白質（或亞基）功能的變化，稱為蛋白質的變構效應。蛋白質的兩性電離 蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 蛋白質的膠體性質 蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內。 * 蛋白質膠體穩定的因素顆粒表面電荷水化膜蛋白質的變性、沉淀和凝固 * 蛋白質的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，蛋白質分子的特定空間構象被破壞，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。若蛋白質變性程度

5、較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性。復性(renaturation)蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。蛋白質的呈色反應茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發生茚三酮反應。 雙縮脲反應(biuret reaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。蛋白質的分離和純化（一）透析及超濾法* 透析(d

6、ialysis)：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。* 超濾法：應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。（二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。 *免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物

7、的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 （三）電泳蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術, 稱為電泳(elctrophoresis) 。根據支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。 幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳：通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳：是蛋白質組學研究的重要技術。瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis，AGE）毛細管電泳（capillary electrophores

8、is，CE）（四）層析層析(chromatography)分離蛋白質的原理待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的 。蛋白質分離常用的層析方法* 離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。* 凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析：利用各蛋白質分子大小不同分離。凝膠層析又叫分子篩層析。 分子篩是具有三維空間網狀結構的物質，有天然的，也可人工合成。根據網孔不同可制成不同規格。具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。

9、常用分子篩： 葡聚糖凝膠（Sephadex） 型號：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分離大蛋白質、小蛋白質，除鹽 瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA） 孔徑大，用于分離大分子物質 聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-GelP）凝膠層析原理： 1、分子量大的物質不能進入凝膠粒子內部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質遷移速度快； 2、小分子物質要通過凝膠網孔進入凝膠粒子內部，所以小分子物質遷移速度慢。（五）超速離心* 超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。

10、*蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系數與蛋白質的密度和形狀相關 。核酸結構與功能核酸的基本組成DNA的空間結構與功能RNA的種類及基本結構核酸的一般理化性質核酸的基本組成單位是核苷酸 (nucleotide)。堿基戊糖磷酸核苷酸核苷核酸DNA的基本組成單位是脫氧核糖核苷酸 。RNA的基本組成單位是核糖核苷酸 。元素組成： C H O N P （S）嘌呤 嘧啶 堿基腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有核苷酸的結構每種核酸都含有四種堿基 。核苷酸：AMP, GMP, U

11、MP, CMP脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP 核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。 DNA雙螺旋結構模型要點 1. 兩條鏈反向平行，圍繞同一中心軸構成右手雙螺旋 (double helix)。螺旋直徑2nm，表面有大溝和小溝。2. 磷酸-脫氧核糖骨架位于螺旋外側，堿基垂直于螺旋軸而伸入內側。每圈螺旋含10個堿基對 (bp)，螺距為3.4nm。3. 兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，A對T有兩個氫鍵，C對G有三個氫鍵，這種A-T、C-G配對的規律，稱為堿基互補規則。4. 維持雙螺旋穩定的因素：橫向為氫鍵，縱向為堿基間的堆積力。(1) B-DNA螺旋： D

12、NA在92%相對濕度的鈉鹽中的構型標準的Watson, Crick雙螺旋，細胞正常狀態下DNA存在的構型。(2) A-DNA螺旋：DNA在75%相對濕度的鈉鹽中的構型。(3) C-DNA螺旋：DNA在66%相對濕度的鋰鹽中的構型。(4) Z-DNA螺旋：左手的DNA螺旋，這種螺旋可能在基因表達或遺傳重組中起作用。DNA的超螺旋結構及其在染色質中的組裝（三級結構）（一）DNA的超螺旋結構超螺旋結構(superhelix 或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構。 正超螺旋(positive supercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同 負超螺旋(negative supe

13、rcoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反 意義DNA超螺旋結構整體或局部的拓撲學變化及其調控對于DNA復制和RNA轉錄過程具有關鍵作用。 自從1965年Vinograd等人發現多瘤病毒的環形DNA的超螺旋以來，現已知道絕大多數原核生物都是共價封閉環(covalently closed circle,CCC)分子，這種雙螺旋環狀分子再度螺旋化成為超螺旋結構(superhelix或supercoil)。原核生物DNA的高級結構（三）DNA在真核生物細胞核內的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質構成，其基本單位是 核小體(nucleosome)。核小體的組成DNA：約200bp 組蛋白：H1H2A，

14、H2BH3H4串珠狀核小體結構核小體螺線管真核生物染色體DNA組裝串珠狀核小體DNA雙螺旋片段染色質纖維伸展形染色質片段密集形染色質片段整個染色體動物細胞內主要RNA的種類及功能信使RNA的結構與功能hnRNA 內含子(intron)mRNA * mRNA成熟過程 外顯子(exon)* mRNA結構特點1. 大多數真核mRNA的5末端均在轉錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結構：m7GpppNm-。2. 大多數真核mRNA的3末端有一個多聚腺苷酸 (polyA)結構，稱為多聚A尾。帽子結構mRNA核內向胞質的轉位mRNA的穩定性維系翻譯起始的調控 帽子結構和多

15、聚A尾的功能mRNA的功能：作為蛋白質合成的模板。* tRNA的一級結構特點 含稀有堿基較多 3末端為 CCA-OH 5末端大多數為G 由7090個核苷酸組成轉運RNA的結構與功能* tRNA的二級結構三葉草形氨基酸臂額外環* tRNA的三級結構 倒L形* tRNA的功能活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。* rRNA的結構核蛋白體RNA的結構與功能* rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質生物合成的場所。核糖體的組成原核生物真核生物小亞基30S40SrRNA16S18S蛋白質21種33種大亞基50S60SrRNA23S5S28S5.8S5S蛋白質33種49種核糖體70S80S核酸

16、的一般理化性質核酸為多元酸，具有較強的酸性；游離態的核酸等電點較低，一般與金屬離子結合存在，提高其溶解度；pH411之間，核酸較為穩定；核酸（DNA和RNA）都是極性分子，都溶于水，而不溶于有機試劑；DNA是高分子物質，粘度極大； 在260nm波長有最大吸收峰，是由堿基的共軛雙鍵決定的。這一特性常用作核酸的定性、定量分析。1. DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50 g/ml雙鏈DNA40 g/ml單鏈DNA（或RNA）20 g/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0OD260的應用DNA的變

17、性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。變性因素：過量酸，堿，加熱等。 例如：慢慢地升高DNA溶液的溫度，隨著溫度的升高，堿基對之間的氫鍵被破壞，越來越多的堿基對被拆開，當DNA的溶液被加熱到一定溫度以上時，雙鏈DNA結構被破壞，最后雙鏈完全分開，形成兩個單鏈。DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂注意與DNA降解區分變性后理化性質的主要改變：OD260增高粘度下降核酸復性時，紫外吸收降低，由于核酸復性而引起紫外吸收降低的現象，稱為減色效應。 由于核酸變性而引起紫外吸收增加的現象，稱之增色效應。DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性時其溶液OD2

18、60增高的現象。解鏈曲線：在連續加熱DNA的過程中以溫度對A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。由雙螺旋到變性狀態之間的陡變區反映了雙螺旋DNA中堆積的、形成氫鍵的堿基對的破壞程度。 Tm：紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(melting temperature, Tm)。其大小與G+C含量成正比。DNA的復性與分子雜交 DNA復性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性。減色效應DNA復性時，其溶液OD260降低。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(anneali

19、ng) 。酶 化 學酶的分子結構與功能酶促反應的特點與機理酶促反應動力學酶活性的調節酶的不同形式單體酶(monomeric enzyme) 寡聚酶(oligomeric enzyme) 多酶體系(multienzyme system) 多功能酶(multifunctional enzyme)或串聯酶(tandem enzyme) 酶的分子組成 結合酶 (conjugated enzyme) 單純酶 (simple enzyme)酶蛋白 (apoenzyme)輔助因子(cofactor)全酶(holoenzyme)決定反應的特異性決定反應的種類與性質金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與

20、酶結合緊密，提取過程中不易丟失。 金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結合不甚緊密。 輔助因子(cofactor) 金屬離子蛋白質輔酶小分子有機化合物金屬離子的作用 參與催化反應，傳遞電子（細胞色素中Fe3+ Cu2+）； 在酶與底物間起橋梁作用（激酶中Mg2+與ATP結合 ）； 穩定酶的構象（羧肽酶 Zn2+）； 中和陰離子，降低反應中的靜電斥力等。小分子有機化合物的作用（B族維生素）參與酶的催化過程，在反應中傳遞電子、質子或一些基團。蛋白質輔酶（protein coenzyme） 參與基團轉移或氧化還原反應，主要通過遞氫與遞電子起作

21、用。輔助因子按其與酶蛋白結合的緊密程度分為 輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結合疏松，可用透析或超濾的方法除去。（非共價鍵） 輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。（共價鍵）酶的活性中心必需基團(essential group)酶分子中氨基酸殘基側鏈的化學基團中，一些與酶活性密切相關的基團。酶的活性中心(active center)或稱活性部位(active site)，指必需基團在空間結構上彼此靠近，組成具有特定空間結構的區域，能與底物特異結合并將底物轉化為產物。活性中心內的必需基團結合基團(binding group)與底物相結合催化

22、基團(catalytic group)催化底物轉變成產物 維持酶活性中心應有的空間構象所必需。活性中心外的必需基團構成酶活性中心的常見基團：His的咪唑基、Ser的OH、Cys的SH、Glu的-COOH。結合部位 ：酶分子中與底物特異結合的部位或區域一般稱為結合部位，也稱特異性決定部位。催化部位：直接參與催化反應，底物的敏感鍵再次部位被切斷或形成，生產產物。酶分子中促使底物發生化學變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結合部位決定酶的專一性催化部位決定酶所催化反應的性質 調控部位 Regulatory site：酶分子中存在著一些可以與其他分子發生某

23、種程度的結合的部位，從而引起酶分子空間構象的變化，對酶起激活或抑制作用。酶的專一性取決于酶活性中心的結構特異性。保持活性中心的空間結構是維持酶活性的必需。酶原(zymogen):無活性的酶的前身。酶激活機制主要是分子肽一處或多處斷裂，同時使分子構象發生一定程度的改變，從而形成酶活性必須的構象。酶活性部位的共同特點：酶活性部位在酶分子的總體積中只占相當小的部分，通常只占整個酶分子體積的1%2%；酶的活性部位是一個三維實體（空間概念）：不是點、線、面的概念；酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補，而是在結合過程中二者發生一定的構象變化后才互補的：此動態的辨認過程稱為誘導契合；酶的活性部位是位于酶分

24、子表面的一個裂縫內，底物分子或底物分子的一部分結合到裂縫內并發生催化作用；底物通過次級鍵結合到酶上：酶與底物形成ES復合物主要靠氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用；酶活性部位具有柔性或可運動性：活性部位更易被破壞。（一）酶促反應具有極高的效率 酶促反應的特點酶的催化效率通常比非催化反應高1081020倍，比一般催化劑高1071013倍。酶加速反應的機理是降低反應的活化能(activation energy)。一種酶僅作用于一種或一類化合物，或一定的化學鍵，催化一定的化學反應并生成一定的產物。酶的這種選擇性稱為酶的特異性或專一性。* 酶的特異性(specificity)（二）酶促反應具有高度的特

25、異性（選擇性）絕對特異性(absolute specificity)相對特異性(relative specificity)立體結構特異性(stereo specificity)（三）酶促反應的可調節性對酶生成與降解量的調節 如酶原激活及激素控制等酶催化效力的調節 如抑制劑調節、共價修飾調節、反饋調節等通過改變底物濃度對酶進行調節酶的主要成份是蛋白質。酶促反應一般在pH 5-8 水溶液中進行，反應溫度范圍為20-40C。高溫或其它苛刻的物理或化學條件，將引起酶的失活。（四）反應條件溫和,易受外界環境的影響酶促反應的機理（一）酶-底物復合物的形成與誘導契合假說酶底物復合物 E + S E + P

26、ES 中間產物（ES）學說 在酶催化的反應中，第一步是酶與底物形成酶底物中間復合物。當底物分子在酶作用下發生化學變化后，中間復合物再分解成產物和酶。許多實驗事實證明了ES復合物的存在。ES復合物形成的速率與酶和底物的性質有關。鎖鑰學說酶催化作用的本質是酶的活性中心與底物分子通過短程非共價力(如氫鍵,離子鍵和疏水鍵等)的作用，形成E-S反應中間物。使底物的價鍵狀態發生形變或極化，起到激活底物分子和降低過渡態活化能作用。 誘導契合假說(induced-fit hypothesis)酶與底物相互接近時，其結構相互誘導、相互變形和相互適應，進而相互結合。誘導契合假說（二）具體幾種可能的作用形式趨近（鄰

27、近）和定向效應變形或張力作用多功能催化 酸堿催化 共價催化 金屬離子催化趨近（鄰近）效應：底物分子結合在酶分子表面的某一狹小局部區域，其反應基團互相靠近，從而降低了進入過渡態所需的活化能。定向效應：酶可使反應物在其表面對著特定的基團幾何的定向。在酶促反應中，底物分子結合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應速度；另一方面，由于活性中心的立體結構和相關基團的誘導和定向作用，使底物分子中參與反應的基團相互接近，并被嚴格定向定位，使酶促反應具有高效率和專一性特點。趨近（鄰近）效應和定向效應張力作用這是一個形成內酯的反應。當 RCH3時，其反應速度比 RH的情況快31

28、5倍。由于-CH3體積比較大，與反應基團之間產生一種立體排斥張力，從而使反應基團之間更容易形成穩定的五元環過渡狀態。 酶與底物結合后使底物的某些敏感鍵發生變形，從而使底物接近于過渡態，同時由于底物的誘導，酶分子的構象也會發生變化，并對底物產生張力作用使底物變形，促進ES進入過渡狀態。多功能催化作用酶的活性中心部位，一般都含有多個起催化作用的基團，這些基團在空間有特殊的排列和取向，可以對底物價鍵的形變和極化及調整底物基團的位置等起到協同作用，從而使底物達到最佳反應狀態。酶促反應動力學研究各種因素對酶促反應速度的影響。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。底物濃度對反應速度

29、的影響矩形雙曲線1913年Michaelis和Menten提出反應速度與底物濃度關系的數學方程式，即米曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelis equation)。VmaxS Km + S 當v=Vmax/2時KmS 1. Km值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 Km與Vmax的意義米氏常數Km 的意義不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數。同一種酶如果有幾種底物那么針對各底物的Km也不同。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。催化可逆反應對對正逆兩向底物的Km往往不同。測定這些Km值的差別對于了解酶在細胞內的主要催化方向及生理功能有重要意義。測定連鎖反應的不同酶的Km可以找到代謝過程的限速步驟；了解酶的Km和底物在細胞內的濃度可以推測該酶在細胞內是否受到底物的調節；測定抑