1、4發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)思考題1、發(fā)酵工業(yè)中污染雜菌的危害及其預(yù)防措施2、滅菌、消毒、除菌與防腐3、滅菌的常用方法及其機(jī)理4、濕熱滅菌的理論計(jì)算5、空氣滅菌的常用方法6、簡述好氧發(fā)酵無菌空氣制備的工藝流程與要求。什么是染菌？發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長繁殖。一、發(fā)酵工業(yè)的無菌處理 滅菌（sterilization）是指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象 。消毒（disinfection）是指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除病原微生物的過程，它一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞

2、而不能殺滅細(xì)菌芽孢。消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。除菌（degerming）是用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子 。防腐（antisepsis）就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。如低溫、缺氧、干燥、高滲、添加防腐劑等。1）由于雜菌污染，使發(fā)酵培養(yǎng)基因雜菌的消耗而損失，造成產(chǎn)率的下降；2）由于雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成得率降低或使產(chǎn)品質(zhì)量下降；3）污染的雜菌可能會分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失敗；二、雜菌污染的危

3、害 4）污染的雜菌大量繁殖，會改變反應(yīng)介質(zhì)的pH，從而使生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生異常變化；5）發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解而使生產(chǎn)失敗等。三、發(fā)酵污染及其危害的具體分析 1、染菌對不同菌種發(fā)酵的影響 細(xì)菌：發(fā)酵周期短，主要防止噬菌體的污染；營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌：生長能力差，所需培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，易受生長較快雜菌的污染；霉菌：發(fā)酵周期較長，易染菌。對于有機(jī)酸發(fā)酵，中、后期pH較低不易發(fā)生染菌；酵母：易受生長較快的細(xì)菌及野生酵母的污染。 放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細(xì)菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)

4、生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素迅速破壞。不同產(chǎn)品鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量。灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對細(xì)菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。不同產(chǎn)品對疫苗生產(chǎn)危害很大。現(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。2、污染不同種類和性質(zhì)的微生物的影響（1）污染噬菌體噬菌體的感染力很

5、強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。（2）污染其它雜菌有些雜菌會使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會反復(fù)染菌。 由于接種量較小，生產(chǎn)菌生長一開始不占優(yōu)勢，而且培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，容易污染雜菌。種子染菌對發(fā)酵危害極大，應(yīng)嚴(yán)格控制種子染菌，如在此階段染菌，應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄。3、不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響（1）種子培養(yǎng)期染菌（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌。原因 發(fā)酵

6、前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。在這個時期要特別警惕以防止染菌的發(fā)生。措施 可以用降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整補(bǔ)料量，用酸堿調(diào)pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營養(yǎng)，重新接種再用。發(fā)酵中期染菌，處理困難，危害很大。（3）發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌會嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝。雜菌大量產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產(chǎn)物分泌減少或停止，有時甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產(chǎn)生大量泡沫。措施 降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平

7、可以提前放罐，或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。（4）發(fā)酵后期染菌發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。因此如果染菌不多，對生產(chǎn)影響不大。如果染菌嚴(yán)重，又破壞性較大，可以提前放罐。4、雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1）發(fā)酵染菌對過濾的影響染菌的發(fā)酵液一般發(fā)粘，菌體大多數(shù)自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或很難形成濾餅，導(dǎo)致過濾困難。污染雜菌的種類對過濾的影響程度有差異，如污染霉菌時，影響較小，而污染細(xì)菌時很難過濾。由于過濾困難，過濾時間拉長，影響發(fā)酵液儲罐和過濾設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞了生產(chǎn)平衡。染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而大

8、幅度降低過濾收率，直接影響提取總收率。2）發(fā)酵染菌對提取的影響染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多的水溶性蛋白和其它雜質(zhì)。采用有機(jī)溶劑萃取的提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，很難使水相和溶劑相分離，影響進(jìn)一步提純。采用直接用離子交換樹脂的提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換容量，而且有的雜菌很難用水沖洗干凈，洗脫時與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液，影響進(jìn)一步提純。四、雜菌污染的防治 1、染菌的檢查顯微鏡檢查法：平板劃線培養(yǎng)檢查法：肉湯培養(yǎng)檢查法：發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象觀察法：溶解氧、pH、尾氣中的CO2含量、發(fā)酵液黏度、顏色等的異常變化，都可

9、能是發(fā)生染菌的重要信息。溶解氧水平的異常變化污染好氧性雜菌，溶解氧在短時間內(nèi)下降，并接近零值，長時間不能回升；污染非好氧性雜菌，生產(chǎn)菌受到抑制，耗氧量減少，溶解氧升高。pH異常對于污染產(chǎn)酸菌或利用碳源效率高生長較快的雜菌，會使pH迅速下降。尾氣中CO2含量異常污染雜菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染噬菌體，糖耗減慢，CO2含量減少。2、污染的原因分析染菌的原因復(fù)雜，包括種子帶菌、空氣帶菌、設(shè)備滲漏、培養(yǎng)基或補(bǔ)料液滅菌不徹底、操作失誤、技術(shù)管理不善等。日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析 項(xiàng)目 百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64接種時罐壓跌零 0.19培養(yǎng)基滅菌不透 0.7

10、9總空氣系統(tǒng)有菌 19.96泡沫冒頂 0.48夾套穿孔 12.36盤管穿孔 5.89接種管穿孔 0.39閥門滲漏 1.45攪拌軸密封滲漏 2.09罐蓋漏 1.54其它設(shè)備滲漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.941）從污染雜菌的種類分析污染耐熱芽孢桿菌：培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底；污染不耐熱雜菌：種子帶菌、空氣除菌不徹底、設(shè)備滲漏或操作問題；污染淺綠色菌落雜菌：冷卻盤管滲漏引起；污染霉菌：無菌室滅菌不徹底，或操作問題；污染酵母菌：糖液滅菌不徹底。2）從污染時間分析發(fā)酵前期染菌：種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、操作不當(dāng)或空氣帶菌；發(fā)酵后期染菌：中間補(bǔ)料污染、設(shè)備滲漏或操作問題。3）

11、從染菌程度分析多個罐染菌：種子帶菌、空氣系統(tǒng)問題；個別罐染菌：設(shè)備問題、操作不當(dāng)。3、雜菌污染的途徑及其預(yù)防措施1）種子帶菌種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。加強(qiáng)種子管理，嚴(yán)格無菌操作，種子本身帶菌是可以克服的。種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵一樣有許多因素造成。防止種子帶菌制備種子時對沙土管及搖瓶嚴(yán)格加以控制。沙土制備時要多次間歇滅菌注意接種時的無菌操作子瓶、母瓶的移種和培養(yǎng)無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內(nèi)要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學(xué)藥品滅菌。無菌室要求在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關(guān)燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃

12、度擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風(fēng)，接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風(fēng)機(jī)，進(jìn)風(fēng)口有一粗過濾器，出風(fēng)口有高效過濾器，保證無菌風(fēng)從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進(jìn)入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。2）空氣帶菌從日本工業(yè)技術(shù)院分析空氣帶菌而造成的染菌為19.96。國內(nèi)外空氣除菌技術(shù)雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因?yàn)榭諝獬到y(tǒng)較為復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會導(dǎo)致空氣除菌失敗。防止空氣引起的染菌空氣過濾除菌設(shè)備流程空壓機(jī)儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾器粗過濾空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器

13、長期使用后，棉花和活性炭的體積被壓縮而松動，如果上下端棉花鋪得厚薄不均，厚的一邊阻力大空氣不暢通，薄的一邊空氣容易通過，久而久之，薄的一邊長期受空氣頂吹而使棉花活性炭改變位置，造成過濾器失效。過濾器用蒸汽滅菌時，若被蒸汽冷凝水潤濕就會降低或喪失過濾效能，滅菌完畢應(yīng)立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。3）設(shè)備滲漏 設(shè)備滲漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。從日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所對染菌原因分析發(fā)現(xiàn)，這類染菌占33.85。所以說加強(qiáng)設(shè)備本身及附屬零部件的嚴(yán)密度檢查，對制服染菌是極其主要的，也是重要的。防止設(shè)備滲漏發(fā)酵設(shè)備及附件由于化學(xué)腐蝕、電化學(xué)腐蝕，

14、物料與設(shè)備摩擦造成機(jī)械磨損以及加工制作不良等原因會導(dǎo)致設(shè)備及附件滲漏。設(shè)備上一旦滲漏，就會造成染菌，例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會通過漏孔而進(jìn)入發(fā)酵罐中招致染菌。閥門滲漏也會使帶菌的空氣或水進(jìn)入發(fā)酵罐而造成染菌。設(shè)備上的漏隙如果肉眼能看見，容易發(fā)現(xiàn)，也容易治理；但有的微小泄漏，肉眼看不見，必須通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn) 。試漏方法可采用水壓試漏法。即被測設(shè)備的出口處裝上壓力表，將水壓入設(shè)備，待設(shè)備中壓力上升到要求壓力，關(guān)閉進(jìn)出水，看壓力有否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，可以用稀堿溶液壓入設(shè)備，然后用蘸有酚酞的紗布揩，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。閥門滲漏可

15、以用集氣桶來試漏。方法是先在集氣桶中裝滿水，然后關(guān)閉所有閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到要求壓力，一般一公斤以上。由于集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，即這根管子的閥門漏氣。4）滅菌不徹底滅菌技術(shù)的好壞與滅菌質(zhì)量很有關(guān)系蒸汽通入培養(yǎng)基。升溫快慢、保溫時間、泡沫的產(chǎn)生；蒸汽總壓是否達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中的雜菌數(shù)量因季節(jié)而有很大差別。如上海第四制藥廠在卡那霉素生產(chǎn)中，于炎熱的夏季將連續(xù)滅菌預(yù)熱至800C的培養(yǎng)基采樣培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)無法計(jì)數(shù)的大量的芽孢桿菌；而在冬季取樣的培養(yǎng)中，則僅發(fā)現(xiàn)23個芽孢桿菌。原材料儲存和保管，如液胨、玉米漿、母液糖等有機(jī)原料雜菌的數(shù)量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設(shè)備的清洗質(zhì)量有

16、無滅菌的死角對減少或避免染菌仍然是十分必要的。 五、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)1化學(xué)試劑滅菌法：常用試劑有甲醛、氯氣（或次氯酸鈉）、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、季銨鹽（如新潔爾滅）、臭氧等。這些物質(zhì)易與微生物細(xì)胞中的一些成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，如使蛋白質(zhì)變性、酶類失活、破壞細(xì)胞膜通透性而殺滅微生物。由于化學(xué)試劑也會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，而且加入培養(yǎng)基后不易去除，它不能用于培養(yǎng)基的滅菌，但染菌后的培養(yǎng)基可用化學(xué)藥劑處理。 2輻射滅菌：利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺滅微生物。如紫外線（穿透力低，僅適用于表面消毒和空氣消毒）與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)而使菌體死亡；（0.01-0.14nm）的X射線、Co60產(chǎn)生的射線

17、，它們含極高的能量，可使菌體內(nèi)的水和有機(jī)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的離子化反應(yīng)，形成OH-、H2O2和有機(jī)過氧化物，從而在微生物體內(nèi)引起氧化連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致微生物菌體迅速死亡。近年興起了微波滅菌。 3過濾除菌法適用于澄清液體和氣體的除菌。是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。 4高溫滅菌法： 1）干熱滅菌法160下保溫1-2小時。干熱對微生物有氧化、使細(xì)胞蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮等效應(yīng)而使菌體死亡。2）火焰滅菌法滅菌徹底，但僅適用于接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌。3）濕熱滅菌法(工業(yè)上的蒸氣滅菌裝置)：濕熱滅菌要比干熱滅菌更有效，

18、這一方面是由于濕熱易于傳遞熱量，蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時會放出大量的冷凝熱，另一方面是由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，從而加速其變性。很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。一般的濕熱滅菌條件：121，30min。高壓蒸汽滅菌是發(fā)酵工業(yè)最常用的方法，能有效地殺滅雜菌，但高溫也破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。 消除高溫有害影響的措施（1）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（2）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（3）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌（在112即0.

19、57kgcm2或8磅英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；（4）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌。4)間歇滅菌法，又稱丁達(dá)爾滅菌法或分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80100下蒸煮1560分鐘，以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，然后置室溫或37下保溫過夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽，第二天再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復(fù)3天，即可在較低溫度下達(dá)到徹底滅菌的效果。滅菌設(shè)備高壓蒸汽滅菌 生產(chǎn)中使用高壓蒸汽滅菌鍋的型號很多：手提式滅菌鍋立式或臥式滅菌鍋大型滅菌鍋六、發(fā)酵培養(yǎng)基與設(shè)備管道滅菌某些分子的分解和分子內(nèi)部的重新排列的反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)。雜菌雖然是

20、一個復(fù)雜的高分子體系，但其受熱被殺死，主要原因是高溫能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)屬與單分子反應(yīng)，因此雜菌在一定溫度下受熱死亡也遵循單分子反應(yīng)方程。1、濕熱滅菌原理對微生物進(jìn)行濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的微生物數(shù)量成正比，即 式中，N為培養(yǎng)基中活微生物的個數(shù)；t為微生物受熱時間；k為比死亡速率。 若開始滅菌時（t0），培養(yǎng)基中活微生物數(shù)為N0，將上式積分可得 即 隨溫度的變化，比死亡速率k值有很大的變化，溫度對k的影響遵循阿侖尼烏斯定律。或A阿累尼烏斯常數(shù)，1/s，對指定反應(yīng)來說為一常數(shù)；E反應(yīng)的活化能；R摩爾氣體常數(shù)；T熱力學(xué)溫度。 由實(shí)驗(yàn)測得一微生物死亡反應(yīng)在一系列不同溫度

21、時的k值，以對作圖，可得一直線。直線的斜率為，截距為，可求得該反應(yīng)的活化能。 培養(yǎng)基在滅菌以前，存在各種各樣的微生物，它們的k各不相同，k值越小，則此微生物越耐熱。在計(jì)算時，可以對熱抵抗力較大的芽孢桿菌的k進(jìn)行計(jì)算，這時A可以取1.341036 s-1，E可以取2.844105J/mol，這樣得到了只隨滅菌溫度而變的滅菌速率常數(shù)k的簡化計(jì)算公式，即 若要求滅菌后絕對無菌，即N=0，則從上面公式可以看出滅菌時間t將等于無窮大，這是不可能的，故培養(yǎng)液滅菌后，以在培養(yǎng)液中還殘留一定活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)算。工程上，通常以=10-3個/罐，即雜菌污染降低到被處理的每1000罐中只殘留1個活菌的程度，此數(shù)已滿足生

22、產(chǎn)要求。 某發(fā)酵罐，內(nèi)裝培養(yǎng)基80m3，在121下進(jìn)行分批滅菌。設(shè)每毫升培養(yǎng)基中含耐熱的芽孢為107個，求滅菌時間？ 影響培養(yǎng)基滅菌的因素 1）pH值的影響 pH值對微生物的耐熱性影響很大，pH為6.08.0時微生物最不易死亡， pH 6.0時氫離子易滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)。 2）培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的成分中，油脂、糖類、蛋白質(zhì)都是傳熱的不良介質(zhì)，會增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。濃度較高的培養(yǎng)基相對需要較高溫度和較長時間滅菌。高濃度的鹽類，色素則削弱其耐熱性，故較易滅菌。3）培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì) 培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說來，含有顆粒對培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較

23、大顆粒，特別是存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時，會影響滅菌效果，必須過濾除去。2、分批滅菌培養(yǎng)基的分批滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱實(shí)罐滅菌。在工業(yè)上，培養(yǎng)基的分批滅菌無需專門的滅菌設(shè)備，設(shè)備投資少，滅菌效果可靠，對滅菌用蒸汽要求低（0.2-0.3Mpa表壓），但因其滅菌溫度低、時間長而對培養(yǎng)基成分破壞大，對操作難于實(shí)現(xiàn)自動控制。分批滅菌的過程包括升溫、保溫和降溫三個階段。1）培養(yǎng)基的預(yù)熱滅菌時培養(yǎng)基需通過夾套或蛇管先加熱到8090，然后再導(dǎo)入蒸汽升溫至120130。預(yù)熱的目的一是防止直接導(dǎo)入蒸汽時由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫差過大而產(chǎn)生大量冷凝

24、水使培養(yǎng)基稀釋；二是防止直接導(dǎo)入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起物料外溢。2）培養(yǎng)基滅菌將蒸汽從進(jìn)氣口、排料口或取樣口直接導(dǎo)入罐內(nèi)，使罐溫上升至120130，并保溫30min。3）降溫關(guān)閉蒸汽，先自然冷卻10分鐘左右，通冷卻水進(jìn)行冷卻，當(dāng)罐內(nèi)溫度降至70以下時，啟動攪拌槳攪拌，慢速攪動培養(yǎng)基，加速冷卻。當(dāng)蒸汽閥門關(guān)閉以及通冷卻水后，發(fā)酵罐的罐壓將迅速下降，當(dāng)罐內(nèi)壓力降至0.03MPa時，必須間隙開啟進(jìn)氣閥，讓無菌空氣進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)，并使罐壓保持在0.03-0.05 MPa之間，以罐內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓而吸入外界空氣。在引入無菌空氣前，罐內(nèi)壓力必須低于空氣壓力，否則罐內(nèi)物料（培養(yǎng)基）將倒流進(jìn)行空氣過濾器。滅菌

25、時總蒸汽壓力不低于0.3-0.4 Mpa，使用壓力不低于0.2 Mpa。應(yīng)該指出，在分批滅菌時，升溫階段對滅菌亦是有貢獻(xiàn)的。 3、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌 連續(xù)滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐時進(jìn)行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱之為連消。連續(xù)滅菌時，培養(yǎng)基在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度（一般為130-140度），短時間保溫（一般為5-8min）后，被快速冷卻，再進(jìn)入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。組成培養(yǎng)基的不同成分（耐熱與不耐熱、糖與氮源）可在不同溫度下分開滅菌，以減少培養(yǎng)基受熱破壞的程度。 培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌具有對培養(yǎng)基破壞小、可以實(shí)現(xiàn)自動控制、提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率、蒸汽用量平穩(wěn)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，尤其在

26、培養(yǎng)基體積較大時。但對加熱蒸汽的壓力要求較高，一般不小于0.45Mpa。同時連續(xù)滅菌需要一組附加設(shè)備，設(shè)備投資大。 培養(yǎng)基連消工藝流程圖 分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較 滅菌方式 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 連續(xù)滅菌 1、滅菌溫度高，可減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的損失； 2、操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定； 3、易于實(shí)現(xiàn)管道化和自控操作； 4、避免了反復(fù)的加熱和冷卻，提高了熱的利用率； 5、發(fā)酵設(shè)備利用率高； 1、對設(shè)備的要求高，需另外設(shè)置加熱冷卻裝置； 2、操作較麻煩； 3、染菌的機(jī)會多； 4、不適合于含大量固體物料的滅菌； 5、對蒸汽的要求高； 分批滅菌 1、設(shè)備要求低，不需另外的加熱冷卻裝置； 2、操作要求低，適于手動操作； 3、適合于小批量生產(chǎn)規(guī)模； 4、適合于含有大量固體物質(zhì)的培養(yǎng)基的滅菌； 1、培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)損失較多，滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量下降； 2、需進(jìn)行反復(fù)的加熱和冷卻，能耗較高； 3、不適合于大規(guī)模生產(chǎn)過程的滅菌； 4、發(fā)酵罐的利用率較低； 七、空氣除菌 好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣，空氣要作到絕對無菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟(jì)的。發(fā)酵對無菌空氣的要求是 ：無菌，無灰塵，無雜質(zhì)，無水，無油，正壓等幾項(xiàng)指標(biāo)；發(fā)酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發(fā)酵過程中不因無菌空氣染菌而造成損失即可。在工程設(shè)計(jì)中一般要求1000次使用