1、免疫組織化學的概念： 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內

2、抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。免疫組化常用的染色方法有哪些？根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質對某種組

3、織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。抗體的保存：抗體儲存容器應由不吸附蛋白質的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L），就應另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數已稀釋的抗體應存在4-8條件下，以免凍融對抗體蛋白產生有害效應。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應保存于-20條件下，并避免反復凍融。冷凍的抗體溶液應置于室溫中緩慢地解凍，應絕對避免用高溫快速解凍。被細菌污染的抗體常會出現

4、假陽性結果，應將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉。抗體經真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數稀釋抗體可進行冷凍保存，少數抗體可能會丟失抗原活性。大多數單抗，只要蛋白濃度適當，可在4下保存數月。多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10mlConc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26Thimerosal, 0.01%, added as preservative多聚賴氨酸溶液是廣泛應用的組

5、織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產生較強的黏合力。適用組織學，免疫組織化學，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實驗操作過程中組織掉片。也可用于細胞培養，增加細胞貼壁能力。使用說明免疫學操作步驟（可直接在玻片上涂布）1 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。2 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內，使其溫度到室溫18-263 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。4在60烘箱1小時干燥，或室溫18-26過夜干燥待用。注意1 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子

6、將影響其黏合力。2 用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。4 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8，至少在3個月內是穩定的。5 用過的稀釋液要過濾，若出現渾濁或長菌要丟棄。訂貨信息￥100 / 10ml免疫組化操作規程（一）、儀器設備    1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；    2）水浴鍋（二）、試劑   1）PBS緩沖液（pH7.27.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

7、  2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。  3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。  4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。   5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的

8、HCl配制。  6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。  7）封裱劑：    a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.09.5）等量混合；     b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.09.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.07.4適合于光學顯微鏡標本。 （三）、操作流程   1、脫蠟和水化     脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。    1）組織

9、芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；  2）無水乙醇中浸泡5分鐘；  3）95%乙醇中浸泡5分鐘；   4）70%乙醇中浸泡5分鐘；   2、抗原修復   用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。   1）抗原熱修復   （1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水

10、中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。   （2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95左右，放入組織芯片加熱1015分鐘。   （3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔510分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，K

11、i-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。是以高溫，高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。甲醛和蛋白水解交聯過程中氨基酸側鏈上的某些基團(抗原決定簇)如咪唑、吲哚等基團受到影響，通過120高溫或強堿處理后，可使交聯打開。  2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37，切片也預熱至37，消化時間約為530分鐘；胃蛋白酶消化37時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Co

12、llagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。  3、免疫組織化學染色   SP法    1）脫蠟、水化；    2）PBS洗23次各5分鐘；    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；    4）PBS洗23次各5分鐘；     5）抗原修復；    6）PBS洗

13、23次各5分鐘；    7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。    8）滴加抗50l，室溫靜置1小時或者4過夜或者371小時。    9）4過夜后需在37復溫45分鐘。    10）PBS洗3次各5分鐘；    11）滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時；    12）II抗中可加入0.05%的tween-20。  

14、;  13）PBS洗3次各5分鐘；    14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；    15）PBS或自來水沖洗10分鐘；    16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；    17）自來水沖洗1015分鐘；    18）脫水、透明、封片、鏡檢。     SABC法    1)脫蠟、水化

15、。    2)PBS洗兩次各5分鐘。    3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉510分鐘，蒸餾水洗3次。    4)抗原修復。    5)PBS洗5分鐘。    6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。    7)滴加抗,室溫1小時或者4過夜或者371小時（4過夜后在37復溫45分鐘）。   &

16、#160;8)PBS洗三次每次2分鐘。    9)滴加生物素化二抗,203720分鐘。    10)PBC洗3次每次2分鐘。    11)滴加試劑SABC，203720分鐘。    12)PBS洗4次每次5分鐘。    13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。    14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。 

17、0;   15)脫水、透明、封片、鏡檢。 免疫組化實驗過程中的要點和技巧1 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。 Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。 PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。

18、 2組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。 3切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。 4烤片：60 30分鐘或37 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。 5蠟塊及切片的保存：最好在4保存 6脫片問題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES

19、1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進行下一步。 7滅活內源性酶：HRP系統：3%雙氧水滅活；AP系統：3%HAc滅活。 8暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。 9封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉 10抗體稀釋：應遵循“現用現配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用。 11背景高：在抗體

20、濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1 Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。 12返藍：在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。 13顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。DAB法 顯示過氧化物酶原理 過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應不直接發生：AH2（供氫體）+H2O2A（供氫體的氧化物）+2H2O2實驗可知，有稱為復合物 、的酶底物（受氫體）復合體生成，在復合體最后分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學中所使用的供氫體應是含有色原性基團的發色物質，如奈酚和聯苯胺。免疫組化染色步驟（以

21、ABC法為例）溶液的配置：1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份2. 檸檬酸鹽緩沖液：貯存液：0.1M檸檬酸溶液（A）：21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水 0.1M檸檬酸三鈉溶液（B）：29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水0.01M檸檬酸鹽緩沖液3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇充分混勻4. 20% 甘油：80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水5. 稀釋抗體：1300 ，1400 ，1600 （臨用前配）6. 酒精的配置染色步驟：一步法1. 載玻片 烤箱中 60 40。2. 二甲苯，60 20(水浴箱中)，二甲苯，室溫 15。3. 脫水，100%95%85%75%酒精，每級均為3。4. 蒸餾水沖洗，PBS 515. 微波爐修復抗原：0.01M 檸檬酸鹽緩沖液，99 肺 20