1、.海量資料超值下載*;0微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案.0微生物控制菌檢查方法 片驗證方案.微生物限度檢查檢驗方法驗證報告.微生物檢驗方法驗證方案.22微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案目錄一、 驗證方案的制定二、 驗證方案的起草與審批三、微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案1驗證目的和原理2驗證方法步驟3試驗實施3.1 試驗前的準(zhǔn)備3.2 驗證試驗操作3.3 試驗結(jié)果4驗證結(jié)果評價分析5附件微生物限度檢查方法（平皿法）驗證文件一、 驗證方案的制定.海量資料超值下載*;驗證項目名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A驗證小組組員成員職務(wù)姓名主要工作職責(zé)組長方案設(shè)計責(zé)

2、任人副組長方案實施負責(zé)人組員操作人操作人操作人操作人驗證方案組織實施進度步驟實施日期二、 驗證方案的起草與審批1 驗證方案的起草驗證項目名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A起草部門起草人簽名日期生產(chǎn)部年月日質(zhì)控部年月日2驗證方案的審核與批準(zhǔn)驗證方案審核人：審核日期：年月日驗證方案批準(zhǔn)人：批準(zhǔn)日期：年月日三、微生物限度檢查方法（平皿法）驗證方案1驗證目的和原理1.1驗證目的為確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測定，特制定本方案。驗證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進行，若因特殊原因確需要變更時，應(yīng)報驗證委員會批準(zhǔn)。1.2原理通過比較試驗 4 組中試驗菌的恢

3、復(fù)生長結(jié)果來評價整個檢驗方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。.海量資料超值下載*;2驗證方法步驟2.1 驗證前的準(zhǔn)備進行微生物限度檢查方法（平皿法）驗證前，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結(jié)果沒有影響。試驗菌應(yīng)包括 G-、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。2.2 驗證試驗的操作計劃用 3 個不同批號產(chǎn)品按照微生物限度檢測方法進行平行試驗，通過計算回收率來判斷微生物限度檢查方法是否對產(chǎn)品有影響。2.3 試驗結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株評價方法“尿素維生素 E 乳膏的微生物限度檢查”對檢品中微生物的抑制性， 試驗結(jié)果應(yīng)顯示 3 次獨立的平行試驗中

4、， 稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)不小于 70%，試驗組的回收率也不低于 70%。3試驗實施3.1 試驗前的準(zhǔn)備3.1.1 主要儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器、恒溫烘干箱、凈化工作臺、生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。3.1.2 操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于 10000 級，局部潔凈度為 100 級（或防置同等級凈化工作臺） 。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)該保持對環(huán)境形成正壓，不低于 4.9pa。3.1.3 試驗樣品：尿素維生素 E 乳膏：批號批號批號3.1.4 稀釋液和試劑： PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無菌十四烷酸異丙酯3.1.5 器具無菌培養(yǎng)皿： （直

5、徑 90mm）無菌移液管（5ml）3.1.6 驗證用微生物名稱及其編號實驗菌株的來源：菌株名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉編號由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組成3.1.7 培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)商培養(yǎng)基批號配制日期有效期營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基3.2 驗證試驗操作3.2.1 試驗菌的制備和稀釋將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至 10ml 的無菌營養(yǎng)肉湯中在 3035下培養(yǎng) 1824 小時，將白色念珠菌接種至良馬丁流體培養(yǎng)基中，2328下培養(yǎng) 2448小時。將黑曲霉接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，在 2328下培養(yǎng) 57 天小時。將上述培養(yǎng)物用 0.9%的

6、無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌落數(shù)為 50100cfu 的菌懸液。3.2.2 用不同類別的微生物考察供試液及檢驗程序的抑菌性，將試驗分為 4 組A 樣品試驗組準(zhǔn)確取供試品 10g， 加至含 20ml 無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入 45.海量資料超值下載*;的 PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 100ml，振搖 510 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為 1：10 的供試液。用移液管準(zhǔn)確吸取 1.0ml 供試液至平皿中；并在每個平皿中接種 50100cfu 試驗菌，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個試驗

7、菌平行接種 2 個平皿，按照 平皿法測定其菌數(shù)。B 菌液組在平皿中注入 1ml 的菌液立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以測定所加的菌數(shù)。C 供試品對照組取規(guī)定量的供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品的本底菌數(shù)。D 稀釋劑對照組取相應(yīng)稀釋液 1ml 加入試驗菌，使最終菌濃度為每 ml 供試液含 50100cfu 試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌落數(shù)。3.2.3 培養(yǎng) 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在 3050下培養(yǎng) 48 小時將白色念珠菌、黑曲霉在 2328下培養(yǎng) 72 小時，點計菌落數(shù)。并將結(jié)果記錄于附件 1。3.3 試驗結(jié)果3.3.1 稀釋劑對照組菌的回收率接入菌種尿素

8、維生素E 乳膏批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率稀釋劑對照組菌液組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)100%。3.3.2 試驗組的菌的回收率接入菌種尿素維生素菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率.海量資料超值下載*;E 乳膏批號試驗組供試品對照組大腸埃希菌平均值金黃色葡萄球平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)供試品對照組的平均菌落數(shù)的值）菌液組的平均菌落數(shù)100%。4驗證結(jié)果評價分析質(zhì)控部負責(zé)各項驗證、試驗結(jié)果記錄，驗證小組根據(jù)驗證、試驗結(jié)果進行評價（附

9、件 2） ，起草驗證報告（附件 3） ，報驗證委員會。 （附件 4）驗證委員會負責(zé)對驗證結(jié)果進行綜合評審，做出驗證結(jié)論，發(fā)放驗證證書（附件 5） 。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括：驗證試驗是否有遺漏？驗證實施過程中對驗證方案有無修改？修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)？驗證記錄是否完整？驗證試驗結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求？偏差及對偏差的說明合理？是否需進一步補充試驗？5附件.海量資料超值下載*;附件 1產(chǎn)品試驗組的微生物生長檢查記錄：菌種名稱產(chǎn)品試驗組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉供試品對照組的微生物生長檢查記錄菌種名稱供試品對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大

10、腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉稀釋劑照組的微生物生長檢查記錄菌種名稱陽性對照計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌液組菌種名稱陽性對照計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值.海量資料超值下載*;大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉測試人/測試日期：復(fù)核人/復(fù)核日期：附件 2驗證結(jié)果評價表驗證名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A.海量資料超值下載*;驗證結(jié)果評價及建議確認驗證小組：年月日附件 3驗證報告年月日至年月日，驗證小組根據(jù)批準(zhǔn)的編號為“VF-PR-17-A”的微生物限度檢查方法 （平皿法） 驗證

11、文件對微生物限度檢查法進行了相關(guān)的一系列驗證工作，達到了預(yù)期效果，滋將有關(guān)事項說明如下：驗證方案在實施過程中未做修改；.海量資料超值下載*;驗證方案各項性能指標(biāo)在驗證中未作變動，誤差在允許范圍內(nèi)；驗證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實；驗證結(jié)果符合設(shè)計要求和 GMP 原則要求，可以投入使用。以上情況，請驗證委員會審批！驗證小組年月日附件 4試驗報告審批表驗證名稱微生物限度檢查方法（平皿法）驗證編號VF-PR-17-A驗證內(nèi)容.海量資料超值下載*;審閱會簽質(zhì)量部審核人：年月日驗證委員會意見：批準(zhǔn)人：年月日附件 5.海量資料超值下載*;上海安都藥業(yè)有限公司驗 證 格 證 書編號：VF200501

12、7項目名稱：微生物限度檢查方法（平皿法）驗證根據(jù)我國藥品 GMP 規(guī)范要求，依據(jù)我廠驗證管理制度 ，經(jīng)對該項目進行驗證，結(jié)果符合要求。特發(fā)此證。有效期：自年月日至年月日簽發(fā)人：年月日.海量資料超值下載*;微生物控制菌檢查方法 片驗證方案編碼：表一、驗證方案的起草與批準(zhǔn)1.驗證方案起草起草人：起草時期：年月日2.驗證小組成員：3.驗證方案審核部門審核人日期生產(chǎn)部生產(chǎn)車間QCQA4.驗證方案批準(zhǔn)批準(zhǔn)人：批準(zhǔn)日期：二、驗證方案1.驗證目的和原理1.1 驗證目的本實驗是關(guān)于 片的微生物控制菌檢查試驗的驗證。 驗證結(jié)果應(yīng)顯示對 片的微生物控制菌試驗方法，對檢品中可能存在的微生物沒有抑制作用，符合驗證要求

13、。1.2 原理按照已建立的藥品微生物控制菌檢查方法， 通過已知菌數(shù)試液的對照菌的培訓(xùn)對照， 驗證其操作方法適合該藥品的微生物控制菌的檢測的正確性。2.驗證方法步驟2.1 驗證前的準(zhǔn)備：將所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗的結(jié)果沒有影響。試驗菌應(yīng)選擇相應(yīng)的陰性對照菌。2.2 驗證試驗的操作計劃：用 3 個不同批號產(chǎn)品按照微生物控制菌檢測方法進行平行試驗，通過觀測是否長菌來判斷。2.3 試驗結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)菌株評價方法“ 片”的微生物控制菌檢查試驗對檢品中微生物的抑菌性。 試驗結(jié)果應(yīng)顯示； 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌， 試驗組應(yīng)檢出試驗菌。3.試驗實施3.

14、1 試驗前的準(zhǔn)備3.1.1 主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺。3.1.2 操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于 10000 級，局部潔凈度為 100 級（或放置同等級凈化工作臺） 。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)該保持.海量資料超值下載*;對環(huán)境形成正壓，不低于 5pa。3.1.3 試驗樣品： 片批號：批號：批號：3.1.4 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基批號配制日期有效期至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基BL 增菌培養(yǎng)基MUG 培養(yǎng)基3.1.5 稀釋液：PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以上經(jīng) 115高壓蒸汽滅菌 30min。3.1.6 驗證用微

15、生物名稱及其編號實驗菌株的來源：菌株名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌 CMCC(B) 44102Ec-金黃色葡萄球菌 CMCC(B) 26003Sa-編號由菌名首字母傳代代數(shù)制備日期組成。3.1.7 器具：無菌薄膜過濾器： （孔徑 0.45um 直徑 50mm） 、無菌培養(yǎng)皿（直徑 90mm） 、無菌移液管（5ml）4.驗證方法4.1 試驗菌種的制備和稀釋接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)的營養(yǎng)肉湯或 BL 增菌液 10ml中,3035培養(yǎng) 1824 小時。用無菌 0.9%氯化鈉溶液將上述培養(yǎng)物進行倍比遞增稀釋，制成每 1ml 含菌落數(shù)為 50100cfu 的菌懸液。4.2 實驗方法A 試

16、驗組取 1：10 供試液 10ml 及含大腸埃希菌數(shù)為 50100cfu 的菌懸液 1ml 加入到 100mlBL 增菌液中，3035培養(yǎng) 1824 小時。B 陰性對照組采用金黃色葡萄球菌作為陰性對照用菌。方法同試驗組。5.試驗結(jié)果5.1 驗證用微生物的稀釋度和接種量菌種名稱稀釋度接種濃度（cfu/ml）接種量（ml）大腸埃希菌金黃色葡萄球菌5.2 試驗組和陰性對照組結(jié)果大腸埃希菌批號BL 增菌液MUG靛基質(zhì)試 驗 組陰性對照組.海量資料超值下載*;注：為 1824 小時有菌生長。6.結(jié)論：陰性對照菌試驗：檢出陰性對照菌，大腸埃希菌 18 小時生長。該檢驗方法用于該樣品的控制菌檢驗。檢驗人：復(fù)

17、核人：7.驗證結(jié)果評價分析質(zhì)控部負責(zé)各項驗證、試驗結(jié)果記錄，驗證小組根據(jù)驗證、試驗結(jié)果進行評價，起草驗證報告，報驗證委員會。驗證委員會負責(zé)對驗證結(jié)果進行綜合評審，做出驗證結(jié)論，發(fā)放驗證證書。對驗證結(jié)果的評審應(yīng)包括：驗證試驗是否有遺漏；驗證實施過程中對驗證方案有無修改，修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)；驗證記錄是否完整；驗證試驗結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，偏差及對偏差的說明是否合理，是否需進一步補充試驗。8.最終審批驗證報告由驗證組長審核后，報驗證總負責(zé)人批準(zhǔn)，并簽發(fā)驗證證書。.海量資料超值下載*;驗證報告年月日至年月日，驗證小組根據(jù)批準(zhǔn)的微生物控制菌檢查方法驗證文件對微生物限度檢查法進行了相關(guān)的一系列

18、驗證工作， 達到了預(yù)期效果， 滋將有關(guān)事項說明如下：驗證方案在實施過程中未做修改。驗證方案各項性能指標(biāo)在驗證中未作變動，誤差在允許范圍內(nèi)。驗證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實。驗證結(jié)果符合設(shè)計要求和 GMP 原則要求，可以投入使用。片組分或檢驗條件改變時須重新驗證。以上情況，請驗證委員會審批！驗證小組：年月日.海量資料超值下載*;試驗報告審批表驗證名稱微生物控制菌檢查方法驗證編號驗證內(nèi)容審閱會簽質(zhì)量部審核人：年月日驗證委員會意見：批準(zhǔn)人：年月日.海量資料超值下載*;驗證證書驗證證書編號：驗 證 名 稱：有效期：上述方法已按驗證方案進行驗證，各項驗證結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)要求，批準(zhǔn)按此方法進行本品的控

19、制菌檢查。特發(fā)此證。驗證總負責(zé)人：年月日.海量資料超值下載*;備注：微生物限度檢查檢驗方法驗證報告驗 證 情 況驗證概述我公司于年月日年月日對微生物限度檢查方法進行了方法學(xué)驗證，在驗證過程中分別取用了大腸埃希菌 CMCC(B)44102、金 黃 色 葡 萄 球 菌CMCC(B)26003 、 枯 草 芽 孢 桿 菌CMCC(B)63501、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003菌種，對微生物限度的計數(shù)方法以及控制菌檢查方法進行了驗證。為保證驗證的準(zhǔn)確性，我們同時對其驗證過程中使用的純化水、無菌生理鹽水以及設(shè)備進行了控制，以保證驗證的準(zhǔn)確性。按照驗證方案中的方法進行驗

20、證，以證明其微生物檢驗方法是可靠的，使其產(chǎn)品的檢驗更具有說服力。驗證時間驗證人員負責(zé)驗證部門質(zhì)量部人員參加驗證部門生產(chǎn)部人員驗證結(jié)果見“7 檢測結(jié)果”再驗證時間年月日驗證結(jié)論本次驗證的驗證項目符合方案規(guī)定，驗證程序合理，驗證數(shù)據(jù)可靠，驗證文件可行，驗證的數(shù)據(jù)結(jié)果均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，證明在檢驗產(chǎn)品微生物限度時采用該種檢驗方法能夠符合其檢驗及標(biāo)準(zhǔn)的要求。姓名：年月日.海量資料超值下載*;驗證評價和建議本次驗證按照經(jīng)批準(zhǔn)的驗證方案執(zhí)行，驗證過程中未對驗證方案進行修改，也未產(chǎn)生偏差，驗證試驗項目無遺漏，驗證記錄完整，驗證數(shù)據(jù)可靠，驗證試驗結(jié)果符合要求。姓名:年月日批準(zhǔn)意見：姓名：年月日備注記錄表格7.1

21、試驗樣品樣品 1樣品 2樣品 3名稱批號確認人：日期：7.2產(chǎn)品試驗組微生物生長情況：批號：菌種名稱產(chǎn)品試驗組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期：復(fù)核人：日期：7.3供試品對照組微生物生長檢查情況：批號：菌種名稱供試品對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌.海量資料超值下載*;黑曲霉檢驗人：日期：復(fù)核人：日期：7.4稀釋劑對照組微生物生長檢查情況：批號：菌種名稱稀釋劑對照組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期：復(fù)核人：日期：7.

22、5菌液組微生物生長檢查情況：批號：菌種名稱菌液組計數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗人：日期：復(fù)核人：日期：7.6 稀釋劑對照組菌回收率計算菌種名稱批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率稀釋劑對照組菌液組大腸埃希菌.海量資料超值下載*;平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)100%；回收率應(yīng)均不低于 70檢驗人：日期：復(fù)核人：日期：7.7試驗組菌回收率計算菌種名稱批號菌落計數(shù)（cfu/皿）回收率試驗組供試品對照組菌液組大腸埃希菌.海量資料超值下載*;21平均值

23、金黃色葡萄球菌平均值枯草芽孢桿菌平均值白色念珠菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）菌液組的平均菌落數(shù)100%；回收率應(yīng)均不低于 70檢驗人：日期：復(fù)核人：日期：7.8結(jié)果說明經(jīng)過驗證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為：%、%、%、%、%。稀釋劑回收率為：%、%、%、%、%。.海量資料超值下載*;227.9結(jié)論以上驗證結(jié)果證明，本品（適合/不適合）采用上述方法進行微生物限度檢查。附錄微生物檢驗方法驗證方案一概述： 通過驗證以確認所采用的微生物限度檢測方法適合于湖南金旺稀貴藥業(yè)有限公司所生產(chǎn)原料藥的細菌、 霉菌

24、及酵母菌的測定； 確認所采用的方法適合于所生產(chǎn)原料藥的控制菌的檢查。 根據(jù)樣品特性制定檢驗方法和檢驗條件按制定的方法進行試驗， 根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標(biāo)準(zhǔn)。二目的：通過驗證確認所采用的方法適合于所生產(chǎn)原料藥的微生物限度的測定。三適用范圍：本方案適用于本公司生產(chǎn)的四種原料藥的微生物限度檢驗方法的驗證。四責(zé) 任 人：驗證小組成員及相關(guān)人員。五驗證方案內(nèi)容：1.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、白色念珠菌為驗證用菌株。大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，這三種菌株為細菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲菌為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌和酵母

25、菌計數(shù)驗證用菌株。驗證用菌株的傳代次數(shù)不得才超過 5 代。細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證1.1 當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適用于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌級數(shù)同時進行。1.2驗證菌菌液制備.海量資料超值下載*;231.2.1大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng) 1824 小時。取此培養(yǎng)液1ml 加 0.9%無菌氯化鈉溶液 9ml，采用 10 倍遞增稀釋法，稀釋至 10-61

26、0-7，制成每 1ml含菌數(shù) 50100cfu 的孢子懸浮液。1.2.2白色念珠菌菌液制備： 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml 改良馬丁培養(yǎng)基中， 2328培養(yǎng) 2428 小時；取此培養(yǎng)液 1ml 加 0.9%無菌氯化鈉溶液 9ml，采用 10 倍遞增稀釋法稀釋至 10-610-7，制成每 1ml 含菌數(shù) 50100cfu 的孢子懸浮液。1.2.3黑曲菌菌液制備：接種黑曲菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng) 57 天，加入 35ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸至無菌試管中，取 1ml加無菌氯化鈉溶液 9ml，采用 10 倍遞增稀釋法，稀釋至 10-410-6，

27、制成每 1ml 含數(shù) 50100cfu 的孢子懸液。1.3供試液的制備1.3.1無抑菌活性的供試品供試液的制備1.3.1.1稀釋劑：PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1.3.1.2液體供試品： 供試品 10ml 置錐形瓶中， 加 90ml 稀釋劑， 混勻， 作為供試液（1：10） 。1.3.1.3固體、半固體、粘稠性供試品：稱取供試品 10g 置錐形瓶中，加稀釋劑至 100ml，混勻后，作為供試液（1：10） 。1.3.2具有抑菌活性的供試品試液的制備1.3.2.1當(dāng)供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：1.3.2.1培養(yǎng)基稀釋法：取供試液 2ml，沒 0.2ml 的供試液注一

28、皿或每 0.1ml 的供試液注一皿；或取供試液 1ml 每 0.5ml 的供試液注一皿，傾注 15ml 的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每 1ml 供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為 1ml 的菌落數(shù)。計算每 1ml 供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法技術(shù)規(guī)則報告菌數(shù)。控制菌檢查時可加大增菌液的用量。1.3.2.2離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000 轉(zhuǎn)/分離心 20 分鐘（供試液如有沉淀，先以 500 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘，取全部上清液再離心） ，棄去上清液，留底部集菌液約 2ml，加稀釋液補至原量。1.3.2.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋劑供試液，過

29、濾，沖洗嗎，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。1.3.2.4中和法：選取適宜的中和劑消除供試品的抑菌活性后測定。1.4菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法，取試驗用的 1ml 菌液（約 50100cfu）分別注入平皿中， 立即傾入培養(yǎng)基， 每株試驗菌平行制備 2 個平皿， 按平皿法測定其菌落數(shù)。1.5試驗組1.5.1平皿法：取試驗可能用的最低稀釋級 1ml 供試液和 50100cfu 試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。1.5.2 培養(yǎng)基稀釋法 （平皿法） ： 取試驗可能用的最低稀釋級 1ml 供試液分別注入 N 個平皿中，每個平皿再注入 5

30、0100cfu 試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平均制備 2 個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。1.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入 50100cfu 試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。1.5.4離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋劑供試液，如供試液含許多藥渣，先以 500 轉(zhuǎn)/分鐘離心 35 分鐘，取全部上清液，再以 3000 轉(zhuǎn)/分離心 20 分鐘，取下面 1ml.海量資料超值下載*;24液體，并用稀釋劑洗地管底，將洗滌液與 1ml 液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。1.6供試品對照組取規(guī)定

31、量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同） 。1.7稀釋劑對照組若供試劑需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法額、等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組。用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌。最終濃度為每 1ml 供試液含 50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和技術(shù)方法計算。1.8回收率計算1.8.1試驗組回收率計算試驗組的菌回收率=菌液組的平均菌落數(shù)數(shù)供試品對照組平均菌落試驗組的菌回收率 100%1.8.2稀釋劑對照組回收率計算試驗組的菌回收率=菌液組的平均菌落數(shù)數(shù)稀釋劑對照組平均菌落100%計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進行 3 次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。1.9.

32、在 3 次獨立的平行試驗中， 稀釋劑對照組的菌回收率 （稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的品均菌落數(shù)的百分率）70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，是試驗組菌回收率大于 70%。2. 控制菌檢驗方法與驗證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時， 應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證， 以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應(yīng)進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。2.1驗證用菌株大腸埃希菌、金黃色

33、葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌為驗證用菌株，菌株傳代次數(shù)不得超過 5 代。2.2菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng) 1824 小時；分別取培養(yǎng)液 1ml 加 0.9%無菌氯化鈉溶液，采用 10 倍遞增稀釋法，稀釋至 10-510-7，制成每 1ml 含菌數(shù) 10100cfu 的菌懸液。2.3陰性菌對照組設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。 方法同試驗組， 驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查方法時的陰性對

34、照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。2.4試驗組2.4.1常規(guī)法2.4.1.1大腸埃希菌：取相當(dāng)于 1g 或 1ml 供試品的供試液至 100ml 膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照組加入大腸埃希菌 10100cfu， 陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10100cfu， 3537培養(yǎng) 1824 小時，取此培養(yǎng)物按微生物限度檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。.海量資料超值下載*;252.4.1.2大腸菌群：取含適量（不少于 10ml）的膽鹽乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基管 3 支，分別加入含供試品 1g 或 1ml、0.1g 或 0.1ml、含供試品 0.001g 或 0.001ml 的供試液，陽性菌對照加入大腸埃