1、肝細胞癌細胞免疫治療的研究進展臨床肝膽病雜志 2014-10-11 發表評論 分享作者：第四軍醫大學唐都醫院肝病中心 張野 賈戰生；深圳市漢科生物工程研究所 張明杰肝細胞癌（hepatic carcinoma，HCC）是常見的消化系統惡性腫瘤之一，起病隱匿、發展迅速、病死率高。特別是由于HBV和HCV流行的原因，HCC的發病率和病死率仍在連年上升。在我國，每年死于HCC的患者約11萬，其病死率已經上升為農村和城市惡性腫瘤病死率的第一位和第二位。對大多數不合適手術治療或經皮注射酒精或放射類局部消融技術的HCC患者，可以采用肝動脈栓塞化療（transcateter arterial chemoem

2、bolization，TACE）或全身化療。但由于HCC患者常伴有肝硬化，而肝硬化影響藥物的代謝及活性，所以現有的抗HCC化療藥普遍因毒副作用限制了其抗癌療效。雖然索拉非尼已經證實能夠明顯延長晚期肝癌患者的存活率（約3個月），但因其在老年患者中藥物不良反應的發生率較高，同時對索拉非尼治療無效的患者，目前還沒有二線藥物可選，加之藥物經濟學的因素，限制了索拉非尼在我國的應用。因此，目前急需能延長晚期HCC患者存活期、減少不良反應的新藥，并建立有效的預防措施來預防HCC的發生及復發。免疫治療對HCC具有很大潛力，研究表明，HCC的發生、發展、轉移和復發與機體的免疫系統有密切的關系。如何打破機體免疫耐

3、受、激活機體殺傷腫瘤的功能，是當前HCC免疫治療的主要方向，而細胞免疫治療是其中的重要組成部分。細胞免疫治療可分為主動免疫治療和過繼性免疫治療兩大類。本文主要就近年來HCC免疫細胞治療的研究進展作一綜述。1、主動細胞免疫治療主動免疫治療是指給患者回輸能在體內激發特異性抗腫瘤免疫的細胞，啟動自身免疫保護機制，達到治療腫瘤或預防復發的目的。主動免疫治療的作用范圍廣泛、副作用較小、作用時間較長，主動免疫細胞治療主要包括：樹突狀細胞（DC）治療和自然殺傷（NK）細胞治療。1.1 基于DC的HCC免疫治療  DC是功能最強的抗原遞呈細胞，在以DC為基礎的腫瘤細胞免疫治療方案中，DC的

4、抗原遞呈功能是T、B細胞發揮免疫反應的先決條件，借助DC高表達的主要組織相容性復合體（MHC）I類和II類分子所遞呈的腫瘤抗原肽，聯合CD80、CD86及CD40分子共同作用，加載腫瘤特異性抗原的DC疫苗可以刺激特異性T細胞應答，促進腫瘤特異性T細胞在腫瘤部位聚集，發揮免疫功能。HCC患者接種DC疫苗后，可以增強NK細胞活性，下調調節性T細胞（Treg）比例。由于DC疫苗治療的特異性和在體內免疫效應維持時間長等優點，目前已成為研究熱點，并在肝癌治療中顯示出良好的應用前景。已有研究證明，自體移植DC可使終末期肝癌患者的整體生存時間延長。在15例患者中，2例患者得到了進行部分放療的機會，9例患者病

5、情穩定，4例患者疾病進展，在治療4個月內死亡，但自體移植DC的整體安全性和耐受性良好，為終末期肝癌患者提供了控制疾病和延長生命的機會。而目前的研究主要集中于如何增強DC的抗原遞呈功能，使其發揮更強大的肝癌細胞殺傷功能，主要包括應用外源性化合物刺激DC、轉染腫瘤抑制分子或免疫增強分子及加載腫瘤抗原的方法。利用雙磷酸鹽氨基酸化合物（aminobisphosphonate）唑來膦酸鹽（zoledronate）刺激的DC可以在培養細胞中產生大量的異戊烯焦磷酸，使V9V2 T細胞分泌大量的干擾素（IFN），使V9V2 T細胞的細胞殺傷功能增強，促進HCC患者和結腸癌肝轉移患者腫瘤細胞的壞死和凋亡。將HC

6、C患者分離的DC應用鏈球菌來源的抗腫瘤免疫治療分子OK432聯合白細胞介素（IL）4和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激培養2d，應用TACE注入肝臟中。OK432刺激的DC可使患者在血清中產生高水平的IL-9、IL-15、腫瘤壞死因子（TNF）以及趨化因子CCL4、CCL11，延長腫瘤復發時間和患者壽命。應用串聯重復的微生物熱休克蛋白70（heat shock protein 70）407-426表位肽聯合OK432刺激DC較單獨刺激產生更高水平的的DC表面分子（MHC-I類分子、MHC-II類分子、CD40、CD80、CD86和CDllc），增強Th1型細胞因子（IL-12、

7、TNF和IFN）的表達、誘導高水平的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）增殖和分化，并可有效抑制荷瘤小鼠的腫瘤增殖，延長小鼠壽命。利用腺病毒載體分別將人腫瘤內皮標志物（tumor endothelial marker，TEM）8和父方來源而母方印記的遺傳印記基因PEG（parternally expressed gene）轉導入DC中，兩項研究均發現，轉導的DC可有效誘導抗HCC的CTL增強，促進IFN的分泌，殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。多種方法均可以使DC加載抗原，包括肽脈沖、全蛋白加載和基因工程等。DC加載腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1或腫瘤細胞來源的自噬體DRibbles后可更有效的刺激T細胞增

8、殖和殺傷活性。一項應用DC加載多個腫瘤相關抗原（包括甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖和黑色素瘤抗原基因-1）治療HCC的I/II期臨床試驗發現，此DC疫苗在5位受試者的6次免疫中均有良好的安全性和耐受性，5位受試者均產生可針對腫瘤相關抗原的T細胞應答，但僅有1位患者獲得了臨床應答。雖然DC疫苗的研究是目前的熱點，并已經進入臨床試驗階段，但由于DC疫苗的制備工藝標準不統一，輸注途徑多樣，導致了不同研究的DC免疫治療效果不盡相同。因此，應盡快完善DC疫苗的質量控制和治療的標準化路線圖，以期使DC治療盡早在臨床工作中得以廣泛應用。1.2 基于NK細胞的肝癌細胞免疫治療  NK細胞為固

9、有免疫系統中的重要成員之一，具有抗感染和抗腫瘤功能。NK細胞的作用可以是直接的，不需致敏就可通過釋放穿孔素和顆粒酶而殺傷靶細胞。同時，NK細胞也產生細胞因子（如IFN和TNF），發揮免疫調節作用。這為以NK細胞為基礎的免疫治療或疫苗開發帶來了希望。目前針對NK細胞的抗腫瘤主動免疫細胞治療方案主要包括利用外源性化合物刺激NK細胞和利用基因修飾技術增強NK細胞功能等。應用重組共表達GM-CSF、IL-21和維甲酸早期轉錄因子-1（ribonucleic acid export-1，Rae-1，是NKG2D的配體）的DNA疫苗免疫肝癌小鼠模型，此疫苗免疫后可有效的提高NK細胞和CTL的數量和功能活性

10、，同時降低Treg的表達，進而促進IL-2和IFN的分泌，減緩腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時間。而索拉菲尼也可以通過調節巨噬細胞和NK細胞的相互作用發揮抗肝癌作用。在HCC肝移植治療過程中，同種異體的NK細胞可以發揮適應性免疫治療的作用，供體肝臟內的NK細胞在一定處理條件下可以發揮免疫活性治療的作用，IL-2刺激的肝臟NK細胞具有較強的細胞毒性，表達腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）并分泌IFN，發揮抗HCC的功能。而Jiang等利用基因修飾技術，構建了人IFN基因修飾的NK細胞系，命名為NKL-IFN細胞，

11、此細胞系可穩定分泌IFN，并對NKL-IFN細胞在體外和體內針對HCC的自然殺傷功能進行了分析。研究發現，NKL-IFN細胞對原代人肝癌細胞具有更強的細胞殺傷活性，這可能與NKL-IFN細胞上調了細胞毒性相關基因表達（如穿孔素、粒酶B、Fas配體等）有關。同時，NKL-IFN細胞分泌的細胞因子TNF和IFN也可誘導HCC靶細胞表面Fas的表達增加，使HCC細胞對NK細胞介導殺傷作用的敏感性增強。更為重要的，NKL-IFN細胞可抑制異體肝癌動物模型中HCC腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時間。因此，IFN基因修飾的NK細胞可作為肝癌細胞免疫治療的新方案。然而，目前有關NK細胞治療HCC的臨床試驗研

12、究目前較少，這可能與NK細胞非特異性的殺傷作用可能導致正常組織器官損傷、NK細胞體外培養條件的限制等因素有關。2、過繼性細胞免疫治療過繼性細胞免疫治療是指給患者回輸經過體外激活和擴增至一定數量后具有內在抗腫瘤活性的自體免疫細胞，在體內發揮殺傷腫瘤的作用。過繼性細胞免疫治療方案主要包括：淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokine activated killer cell，LAK 細胞）、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK細胞）等。2.1 LAK細胞治

13、療  LAK細胞是將外周血單個核細胞在體外經高濃度IL-2培養46d后誘導的一種非特異性的殺傷細胞，這類細胞可以殺傷多種對CTL、NK細胞不敏感的腫瘤細胞。目前尚未發現LAK細胞特有的表面標志。許多研究表明，LAK細胞的前體細胞是NK細胞和T細胞。在肝癌治療方面，LAK細胞治療主要輔助應用于手術治療后。Kawata等比較了阿霉素聯合LAK細胞+IL-2對肝癌手術切除后患者生存率的影響，4例患者隨機分為兩組，分別接受LAK細胞+IL-2+阿霉素或單獨接受阿霉素的治療。在手術過程中，患者的脾臟被切除用于制備LAK細胞。患者術后1、2、3年的生存率分別為91.7%、82.9%和7

14、2.5%，略高于單純手術切除組。但兩組患者在總體生存率和累計無病率方面均未見統計學差異。鏷利宇等也對肝癌根治性切除術后TACE聯合LAK細胞+IL-2肝動脈灌注應用進行了研究。結果聯合LAK細胞+IL-2的患者在術后1、2、3年肝內復發率較僅TA-CE的患者明顯降低，2年和3年生存率提高。2.2 TIL治療  TIL是將手術切除的腫瘤組織內分離浸潤的淋巴細胞使用IL-2進行體外培養而產生的一類新型殺傷細胞。TIL的表型具有異質性，TIL中絕大多數細胞呈CD3陽性。不同腫瘤來源的TIL中，CD4+T細胞、CD8+ T細胞的比例有差異，大多數情況下以CD8+T細胞為主。NK細胞

15、的標記（CD16、CD56）在TIL體外加入IL-2培養過程中有先增高后降低的趨勢。TIL的抗腫瘤活性是在腫瘤生長過程中產生的，是腫瘤抗原特異性T細胞。TIL的殺傷活性較LAK細胞更強，但其具有MHC限制性，同時TIL回輸治療存在腫瘤細胞自體回輸的風險，限制了其臨床應用，相應的臨床研究報道也較少。將用IL-2和CD3單克隆抗體活化的TIL經肝動脈輸注給3位肝癌患者，觀察TIL在體內的分布。結果發現，TIL聚集在肝臟，且持續時間達48h。在使用含有TIL的化學免疫治療后，3位患者中有2位出現部分療效。2.3 CIK細胞治療  CIK細胞將人外周血單個核細胞應用多種細胞因子共同

16、培養后獲得一群細胞，同時表達CD3和CD56，又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，CIK細胞可以通過直接殺傷、釋放大量炎性因子以及誘導腫瘤細胞凋亡的作用殺傷腫瘤細胞，具有增殖速度快、殺傷活性高、殺傷腫瘤譜廣泛、對正常組織細胞的復興小以及對多重耐藥的腫瘤細胞依然敏感等特點，被認為是新一代抗腫瘤過繼性細胞免疫治療的首選方案。Takayama等將150位HCC患者手術后分成接受或不接受IL-2及抗CD3活化的CIK細胞過繼性免疫治療，結果發現過繼免疫治療降低了復發率，延緩了第一次復發的時間。同時，CIK細胞治療組明顯延長了無復發存活期及疾病特異性存活，但兩組之間的總體存活率并沒有明顯差異。在我國，王福生教

17、授等率先進行了有關CIK細胞治療原發性肝癌的研究。應用IFN、IL-1、IL-2和CD3單克隆抗體共同培養外周外單個核細胞（PBMC），使其誘導成為CIK細胞，在培養21d后，CD3+CD56+細胞可占19.0%20.5%，在培養28d后，CIK細胞的數量可增殖300500倍。在動物實驗中，CIK細胞抑制腫瘤生長的能力較LAK細胞及PBMC過繼性治療均顯著升高。而最近的臨床研究也對CIK細胞過繼性治療在肝癌中的臨床療效進行了觀察，而一項大樣本的研究針對410例HCC患者在手術后是否進行CIK細胞治療對生存期的影響進行了分析，手術后接受CIK細胞治療的患者總體生存率較單獨接受手術者明顯升高，而C

18、IK細胞治療是一項獨立的預測因素。同時，接受超過8個循環CIK細胞治療的生存期較小于8個循環的患者長；在腫瘤直徑超過5cm的患者中，接受CIK細胞治療的患者生存期較單獨接受手術治療的患者生存期長。Wang等應用（3.23.6）×109個CIK細胞對終末期原發性肝癌患者進行的腹腔灌注，2次/周，灌注2h后進行局部放療，間隔1個月后再次進行治療。共有31例患者接受了平均（4.2±0.6）個療程的治療，隨訪時間為（8.3±0.7）個月，在接受CIK細胞聯合局部放療后，患者外周中CD4+、CD8+和CD3+CD56+細胞均顯著升高，AFP水平和腹圍均降低，疾病控制率為67

19、.7%，平均生存期為8.5個月。Huang等對TACE+RFA+CIK治療HCC的療效與TACE+RFA的療效進行了對比，疾病控制率在TACE+RFA+CIK治療中可達95.3%，且均有更長的總生存期和無病生存期。但由于此項研究的人組患者并非隨機分組，因此疾病輕重、患者的年齡、既往疾病病史等因素均未列人統計中，所得出的結論仍有待進一步證實。而最新的一項臨床薈萃分析發現，CIK細胞治療能夠延長接受TACE或RFA的HCC患者的生存期。3、基于改善腫瘤免疫微環境的細胞治療腫瘤微環境是腫瘤在其發生發展過程中所處的內環境，由腫瘤細胞本身、間質細胞、微血管、組織液及浸潤細胞共同組成。腫瘤微環境內存在許多

20、因素可參與腫瘤組織和免疫細胞的相互作用，包括局部效應細胞功能障礙、細胞因子的免疫調節作用、配體-受體反應以及T細胞代謝活性的調節等。腫瘤微環境是動態的，隨著腫瘤的發生、發展以及治療干預發生著變化，同時具有顯著的異質性。腫瘤微環境，特別是腫瘤免疫微環境（包括抗腫瘤的免疫效應細胞和分子以及免疫抑制性細胞和分子）對于腫瘤的發生、發展和臨床轉歸具有重要的作用，針對腫瘤免疫微環境的細胞治療也成為了目前研究的熱點之一。肝臟免疫微環境的組成復雜，其中，固有免疫主要包括Kupffer細胞、肝血竇內皮細胞以及肝臟內的NK和NKT細胞，Kupffer細胞和NK/NKT細胞分泌多種抗病毒和抗腫瘤的細胞因子。而DC可進行抗原遞呈，活化初始T細胞