1、肝細(xì)胞癌細(xì)胞免疫治療的研究進(jìn)展臨床肝膽病雜志 2014-10-11 發(fā)表評論 分享作者：第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院肝病中心 張野 賈戰(zhàn)生；深圳市漢科生物工程研究所 張明杰肝細(xì)胞癌（hepatic carcinoma，HCC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，起病隱匿、發(fā)展迅速、病死率高。特別是由于HBV和HCV流行的原因，HCC的發(fā)病率和病死率仍在連年上升。在我國，每年死于HCC的患者約11萬，其病死率已經(jīng)上升為農(nóng)村和城市惡性腫瘤病死率的第一位和第二位。對大多數(shù)不合適手術(shù)治療或經(jīng)皮注射酒精或放射類局部消融技術(shù)的HCC患者，可以采用肝動(dòng)脈栓塞化療（transcateter arterial chemoem

2、bolization，TACE）或全身化療。但由于HCC患者常伴有肝硬化，而肝硬化影響藥物的代謝及活性，所以現(xiàn)有的抗HCC化療藥普遍因毒副作用限制了其抗癌療效。雖然索拉非尼已經(jīng)證實(shí)能夠明顯延長晚期肝癌患者的存活率（約3個(gè)月），但因其在老年患者中藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率較高，同時(shí)對索拉非尼治療無效的患者，目前還沒有二線藥物可選，加之藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)的因素，限制了索拉非尼在我國的應(yīng)用。因此，目前急需能延長晚期HCC患者存活期、減少不良反應(yīng)的新藥，并建立有效的預(yù)防措施來預(yù)防HCC的發(fā)生及復(fù)發(fā)。免疫治療對HCC具有很大潛力，研究表明，HCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與機(jī)體的免疫系統(tǒng)有密切的關(guān)系。如何打破機(jī)體免疫耐

3、受、激活機(jī)體殺傷腫瘤的功能，是當(dāng)前HCC免疫治療的主要方向，而細(xì)胞免疫治療是其中的重要組成部分。細(xì)胞免疫治療可分為主動(dòng)免疫治療和過繼性免疫治療兩大類。本文主要就近年來HCC免疫細(xì)胞治療的研究進(jìn)展作一綜述。1、主動(dòng)細(xì)胞免疫治療主動(dòng)免疫治療是指給患者回輸能在體內(nèi)激發(fā)特異性抗腫瘤免疫的細(xì)胞，啟動(dòng)自身免疫保護(hù)機(jī)制，達(dá)到治療腫瘤或預(yù)防復(fù)發(fā)的目的。主動(dòng)免疫治療的作用范圍廣泛、副作用較小、作用時(shí)間較長，主動(dòng)免疫細(xì)胞治療主要包括：樹突狀細(xì)胞（DC）治療和自然殺傷（NK）細(xì)胞治療。1.1 基于DC的HCC免疫治療  DC是功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，在以DC為基礎(chǔ)的腫瘤細(xì)胞免疫治療方案中，DC的

4、抗原遞呈功能是T、B細(xì)胞發(fā)揮免疫反應(yīng)的先決條件，借助DC高表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類和II類分子所遞呈的腫瘤抗原肽，聯(lián)合CD80、CD86及CD40分子共同作用，加載腫瘤特異性抗原的DC疫苗可以刺激特異性T細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞在腫瘤部位聚集，發(fā)揮免疫功能。HCC患者接種DC疫苗后，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，下調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）比例。由于DC疫苗治療的特異性和在體內(nèi)免疫效應(yīng)維持時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為研究熱點(diǎn)，并在肝癌治療中顯示出良好的應(yīng)用前景。已有研究證明，自體移植DC可使終末期肝癌患者的整體生存時(shí)間延長。在15例患者中，2例患者得到了進(jìn)行部分放療的機(jī)會(huì)，9例患者病

5、情穩(wěn)定，4例患者疾病進(jìn)展，在治療4個(gè)月內(nèi)死亡，但自體移植DC的整體安全性和耐受性良好，為終末期肝癌患者提供了控制疾病和延長生命的機(jī)會(huì)。而目前的研究主要集中于如何增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能，使其發(fā)揮更強(qiáng)大的肝癌細(xì)胞殺傷功能，主要包括應(yīng)用外源性化合物刺激DC、轉(zhuǎn)染腫瘤抑制分子或免疫增強(qiáng)分子及加載腫瘤抗原的方法。利用雙磷酸鹽氨基酸化合物（aminobisphosphonate）唑來膦酸鹽（zoledronate）刺激的DC可以在培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生大量的異戊烯焦磷酸，使V9V2 T細(xì)胞分泌大量的干擾素（IFN），使V9V2 T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷功能增強(qiáng)，促進(jìn)HCC患者和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡。將HC

6、C患者分離的DC應(yīng)用鏈球菌來源的抗腫瘤免疫治療分子OK432聯(lián)合白細(xì)胞介素（IL）4和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激培養(yǎng)2d，應(yīng)用TACE注入肝臟中。OK432刺激的DC可使患者在血清中產(chǎn)生高水平的IL-9、IL-15、腫瘤壞死因子（TNF）以及趨化因子CCL4、CCL11，延長腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間和患者壽命。應(yīng)用串聯(lián)重復(fù)的微生物熱休克蛋白70（heat shock protein 70）407-426表位肽聯(lián)合OK432刺激DC較單獨(dú)刺激產(chǎn)生更高水平的的DC表面分子（MHC-I類分子、MHC-II類分子、CD40、CD80、CD86和CDllc），增強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子（IL-12、

7、TNF和IFN）的表達(dá)、誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）增殖和分化，并可有效抑制荷瘤小鼠的腫瘤增殖，延長小鼠壽命。利用腺病毒載體分別將人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物（tumor endothelial marker，TEM）8和父方來源而母方印記的遺傳印記基因PEG（parternally expressed gene）轉(zhuǎn)導(dǎo)入DC中，兩項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC可有效誘導(dǎo)抗HCC的CTL增強(qiáng)，促進(jìn)IFN的分泌，殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長。多種方法均可以使DC加載抗原，包括肽脈沖、全蛋白加載和基因工程等。DC加載腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1或腫瘤細(xì)胞來源的自噬體DRibbles后可更有效的刺激T細(xì)胞增

8、殖和殺傷活性。一項(xiàng)應(yīng)用DC加載多個(gè)腫瘤相關(guān)抗原（包括甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖和黑色素瘤抗原基因-1）治療HCC的I/II期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此DC疫苗在5位受試者的6次免疫中均有良好的安全性和耐受性，5位受試者均產(chǎn)生可針對腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞應(yīng)答，但僅有1位患者獲得了臨床應(yīng)答。雖然DC疫苗的研究是目前的熱點(diǎn)，并已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但由于DC疫苗的制備工藝標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，輸注途徑多樣，導(dǎo)致了不同研究的DC免疫治療效果不盡相同。因此，應(yīng)盡快完善DC疫苗的質(zhì)量控制和治療的標(biāo)準(zhǔn)化路線圖，以期使DC治療盡早在臨床工作中得以廣泛應(yīng)用。1.2 基于NK細(xì)胞的肝癌細(xì)胞免疫治療  NK細(xì)胞為固

9、有免疫系統(tǒng)中的重要成員之一，具有抗感染和抗腫瘤功能。NK細(xì)胞的作用可以是直接的，不需致敏就可通過釋放穿孔素和顆粒酶而殺傷靶細(xì)胞。同時(shí)，NK細(xì)胞也產(chǎn)生細(xì)胞因子（如IFN和TNF），發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。這為以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療或疫苗開發(fā)帶來了希望。目前針對NK細(xì)胞的抗腫瘤主動(dòng)免疫細(xì)胞治療方案主要包括利用外源性化合物刺激NK細(xì)胞和利用基因修飾技術(shù)增強(qiáng)NK細(xì)胞功能等。應(yīng)用重組共表達(dá)GM-CSF、IL-21和維甲酸早期轉(zhuǎn)錄因子-1（ribonucleic acid export-1，Rae-1，是NKG2D的配體）的DNA疫苗免疫肝癌小鼠模型，此疫苗免疫后可有效的提高NK細(xì)胞和CTL的數(shù)量和功能活性

10、，同時(shí)降低Treg的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)IL-2和IFN的分泌，減緩腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。而索拉菲尼也可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的相互作用發(fā)揮抗肝癌作用。在HCC肝移植治療過程中，同種異體的NK細(xì)胞可以發(fā)揮適應(yīng)性免疫治療的作用，供體肝臟內(nèi)的NK細(xì)胞在一定處理?xiàng)l件下可以發(fā)揮免疫活性治療的作用，IL-2刺激的肝臟NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）并分泌IFN，發(fā)揮抗HCC的功能。而Jiang等利用基因修飾技術(shù)，構(gòu)建了人IFN基因修飾的NK細(xì)胞系，命名為NKL-IFN細(xì)胞，

11、此細(xì)胞系可穩(wěn)定分泌IFN，并對NKL-IFN細(xì)胞在體外和體內(nèi)針對HCC的自然殺傷功能進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，NKL-IFN細(xì)胞對原代人肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷活性，這可能與NKL-IFN細(xì)胞上調(diào)了細(xì)胞毒性相關(guān)基因表達(dá)（如穿孔素、粒酶B、Fas配體等）有關(guān)。同時(shí)，NKL-IFN細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF和IFN也可誘導(dǎo)HCC靶細(xì)胞表面Fas的表達(dá)增加，使HCC細(xì)胞對NK細(xì)胞介導(dǎo)殺傷作用的敏感性增強(qiáng)。更為重要的，NKL-IFN細(xì)胞可抑制異體肝癌動(dòng)物模型中HCC腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。因此，IFN基因修飾的NK細(xì)胞可作為肝癌細(xì)胞免疫治療的新方案。然而，目前有關(guān)NK細(xì)胞治療HCC的臨床試驗(yàn)研

12、究目前較少，這可能與NK細(xì)胞非特異性的殺傷作用可能導(dǎo)致正常組織器官損傷、NK細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的限制等因素有關(guān)。2、過繼性細(xì)胞免疫治療過繼性細(xì)胞免疫治療是指給患者回輸經(jīng)過體外激活和擴(kuò)增至一定數(shù)量后具有內(nèi)在抗腫瘤活性的自體免疫細(xì)胞，在體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。過繼性細(xì)胞免疫治療方案主要包括：淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer cell，LAK 細(xì)胞）、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIK細(xì)胞）等。2.1 LAK細(xì)胞治

13、療  LAK細(xì)胞是將外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)高濃度IL-2培養(yǎng)46d后誘導(dǎo)的一種非特異性的殺傷細(xì)胞，這類細(xì)胞可以殺傷多種對CTL、NK細(xì)胞不敏感的腫瘤細(xì)胞。目前尚未發(fā)現(xiàn)LAK細(xì)胞特有的表面標(biāo)志。許多研究表明，LAK細(xì)胞的前體細(xì)胞是NK細(xì)胞和T細(xì)胞。在肝癌治療方面，LAK細(xì)胞治療主要輔助應(yīng)用于手術(shù)治療后。Kawata等比較了阿霉素聯(lián)合LAK細(xì)胞+IL-2對肝癌手術(shù)切除后患者生存率的影響，4例患者隨機(jī)分為兩組，分別接受LAK細(xì)胞+IL-2+阿霉素或單獨(dú)接受阿霉素的治療。在手術(shù)過程中，患者的脾臟被切除用于制備LAK細(xì)胞。患者術(shù)后1、2、3年的生存率分別為91.7%、82.9%和7

14、2.5%，略高于單純手術(shù)切除組。但兩組患者在總體生存率和累計(jì)無病率方面均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。鏷利宇等也對肝癌根治性切除術(shù)后TACE聯(lián)合LAK細(xì)胞+IL-2肝動(dòng)脈灌注應(yīng)用進(jìn)行了研究。結(jié)果聯(lián)合LAK細(xì)胞+IL-2的患者在術(shù)后1、2、3年肝內(nèi)復(fù)發(fā)率較僅TA-CE的患者明顯降低，2年和3年生存率提高。2.2 TIL治療  TIL是將手術(shù)切除的腫瘤組織內(nèi)分離浸潤的淋巴細(xì)胞使用IL-2進(jìn)行體外培養(yǎng)而產(chǎn)生的一類新型殺傷細(xì)胞。TIL的表型具有異質(zhì)性，TIL中絕大多數(shù)細(xì)胞呈CD3陽性。不同腫瘤來源的TIL中，CD4+T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞的比例有差異，大多數(shù)情況下以CD8+T細(xì)胞為主。NK細(xì)胞

15、的標(biāo)記（CD16、CD56）在TIL體外加入IL-2培養(yǎng)過程中有先增高后降低的趨勢。TIL的抗腫瘤活性是在腫瘤生長過程中產(chǎn)生的，是腫瘤抗原特異性T細(xì)胞。TIL的殺傷活性較LAK細(xì)胞更強(qiáng)，但其具有MHC限制性，同時(shí)TIL回輸治療存在腫瘤細(xì)胞自體回輸?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)，限制了其臨床應(yīng)用，相應(yīng)的臨床研究報(bào)道也較少。將用IL-2和CD3單克隆抗體活化的TIL經(jīng)肝動(dòng)脈輸注給3位肝癌患者，觀察TIL在體內(nèi)的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIL聚集在肝臟，且持續(xù)時(shí)間達(dá)48h。在使用含有TIL的化學(xué)免疫治療后，3位患者中有2位出現(xiàn)部分療效。2.3 CIK細(xì)胞治療  CIK細(xì)胞將人外周血單個(gè)核細(xì)胞應(yīng)用多種細(xì)胞因子共同

16、培養(yǎng)后獲得一群細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)CD3和CD56，又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，CIK細(xì)胞可以通過直接殺傷、釋放大量炎性因子以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用殺傷腫瘤細(xì)胞，具有增殖速度快、殺傷活性高、殺傷腫瘤譜廣泛、對正常組織細(xì)胞的復(fù)興小以及對多重耐藥的腫瘤細(xì)胞依然敏感等特點(diǎn)，被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療的首選方案。Takayama等將150位HCC患者手術(shù)后分成接受或不接受IL-2及抗CD3活化的CIK細(xì)胞過繼性免疫治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過繼免疫治療降低了復(fù)發(fā)率，延緩了第一次復(fù)發(fā)的時(shí)間。同時(shí)，CIK細(xì)胞治療組明顯延長了無復(fù)發(fā)存活期及疾病特異性存活，但兩組之間的總體存活率并沒有明顯差異。在我國，王福生教

17、授等率先進(jìn)行了有關(guān)CIK細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的研究。應(yīng)用IFN、IL-1、IL-2和CD3單克隆抗體共同培養(yǎng)外周外單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），使其誘導(dǎo)成為CIK細(xì)胞，在培養(yǎng)21d后，CD3+CD56+細(xì)胞可占19.0%20.5%，在培養(yǎng)28d后，CIK細(xì)胞的數(shù)量可增殖300500倍。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CIK細(xì)胞抑制腫瘤生長的能力較LAK細(xì)胞及PBMC過繼性治療均顯著升高。而最近的臨床研究也對CIK細(xì)胞過繼性治療在肝癌中的臨床療效進(jìn)行了觀察，而一項(xiàng)大樣本的研究針對410例HCC患者在手術(shù)后是否進(jìn)行CIK細(xì)胞治療對生存期的影響進(jìn)行了分析，手術(shù)后接受CIK細(xì)胞治療的患者總體生存率較單獨(dú)接受手術(shù)者明顯升高，而C

18、IK細(xì)胞治療是一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)測因素。同時(shí)，接受超過8個(gè)循環(huán)CIK細(xì)胞治療的生存期較小于8個(gè)循環(huán)的患者長；在腫瘤直徑超過5cm的患者中，接受CIK細(xì)胞治療的患者生存期較單獨(dú)接受手術(shù)治療的患者生存期長。Wang等應(yīng)用（3.23.6）×109個(gè)CIK細(xì)胞對終末期原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行的腹腔灌注，2次/周，灌注2h后進(jìn)行局部放療，間隔1個(gè)月后再次進(jìn)行治療。共有31例患者接受了平均（4.2±0.6）個(gè)療程的治療，隨訪時(shí)間為（8.3±0.7）個(gè)月，在接受CIK細(xì)胞聯(lián)合局部放療后，患者外周中CD4+、CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞均顯著升高，AFP水平和腹圍均降低，疾病控制率為67

19、.7%，平均生存期為8.5個(gè)月。Huang等對TACE+RFA+CIK治療HCC的療效與TACE+RFA的療效進(jìn)行了對比，疾病控制率在TACE+RFA+CIK治療中可達(dá)95.3%，且均有更長的總生存期和無病生存期。但由于此項(xiàng)研究的人組患者并非隨機(jī)分組，因此疾病輕重、患者的年齡、既往疾病病史等因素均未列人統(tǒng)計(jì)中，所得出的結(jié)論仍有待進(jìn)一步證實(shí)。而最新的一項(xiàng)臨床薈萃分析發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞治療能夠延長接受TACE或RFA的HCC患者的生存期。3、基于改善腫瘤免疫微環(huán)境的細(xì)胞治療腫瘤微環(huán)境是腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及浸潤細(xì)胞共同組成。腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在許多

20、因素可參與腫瘤組織和免疫細(xì)胞的相互作用，包括局部效應(yīng)細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用、配體-受體反應(yīng)以及T細(xì)胞代謝活性的調(diào)節(jié)等。腫瘤微環(huán)境是動(dòng)態(tài)的，隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療干預(yù)發(fā)生著變化，同時(shí)具有顯著的異質(zhì)性。腫瘤微環(huán)境，特別是腫瘤免疫微環(huán)境（包括抗腫瘤的免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子以及免疫抑制性細(xì)胞和分子）對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和臨床轉(zhuǎn)歸具有重要的作用，針對腫瘤免疫微環(huán)境的細(xì)胞治療也成為了目前研究的熱點(diǎn)之一。肝臟免疫微環(huán)境的組成復(fù)雜，其中，固有免疫主要包括Kupffer細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞以及肝臟內(nèi)的NK和NKT細(xì)胞，Kupffer細(xì)胞和NK/NKT細(xì)胞分泌多種抗病毒和抗腫瘤的細(xì)胞因子。而DC可進(jìn)行抗原遞呈，活化初始T細(xì)胞