1、電泳技術n1 電泳：帶電粒子在電場中向著與其本身電荷相反的電極移動的過程。n2 電泳技術優點：快速、準確、重現性好n3 電泳方法分類 按電場分：常壓（500V，適用小分子） 支持體分：自由電泳、區帶電泳 儀器裝置分：水平式、垂直式、懸架式n4 電泳條件：水溶液（緩沖液）、支持物（區帶電泳）、電場（電泳儀、電泳槽）一 電泳的基本原理n電泳分離：n移動方向：帶電性質決定n泳動度：帶電顆粒在單位電場強度下的移動速度。 v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vtn影響的因素：n1顆粒本身：帶電、大小、形狀n2 外界因素：電場強度E、pH、離子強度I、電滲、緩沖液粘度及溫度等。二 紙電泳n以濾紙為支

2、持體的電泳技術n操作要點：n1 選擇緩沖液n對顯色劑和紫外光吸收等觀察區帶的方法無影響nA 分離蛋白質，pI 5，選pH8.6的緩沖液（巴比妥緩沖液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)nB 分離氨基酸：鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸醋酸，pH5.9nC 分離核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，檸檬酸pH23nD 分離糖類：HAC-NaAC, pH35n2 濾紙的選擇與處理n層析用濾紙，紙寬23cm/樣品組分，長短影響電場強度。n3 點樣 點圓點（量少）、點條狀（一般），點中間（未知樣品）、點一邊（已知樣品） 干法、濕法n4 電泳 電橋水平、加蓋、電壓穩定、注意時間n5 顯色及分析 蛋白：溴酚蘭、氨黑10

3、B、偶氮胭脂紅B Aa：茚三酮、靛紅 核酸：紫外光下觀察n一般洗脫定量三 薄膜電泳n支持體：薄膜n優點：分辨力較高、簡便、快速、區帶清晰、易于定量、便于保存n廣泛應用于蛋白質和同工酶等的分離分析n操作n1 薄膜的處理與放置n2 點樣 平衡n3 電泳：E 1025V/cm，0.52hn4 顯色四 薄層電泳n將支持物與緩沖液調制成適當厚度的薄層進行電泳。n常用支持物：淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠等n操作：n1 緩沖液選擇n離子強度較高的緩沖液n2 支持物處理n精制品n3 薄層板制作n4加樣：挖溝、混合樣品、填埋n5 電泳n6分析：印染法五 凝膠電泳n支持物：多孔凝膠n聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等n具

4、有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高n最常用聚丙烯酰胺凝膠，原因：n機械強度好，透明有彈性，穩定，無吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。n分類：垂直管型盤狀電泳、垂直板型電泳；n連續、不連續、梯度、SDS凝膠電泳n1 聚丙烯酰胺凝膠的制備n丙稀酰胺（單體）N,N-甲叉雙丙稀酰胺（交聯劑）（催化劑） 聚合n催化劑：n（1）過硫酸銨四甲基乙二胺（TEMED）n（2）核黃素（VitB2）光n改變單體濃度可改變凝膠孔徑n交聯劑對孔徑有影響：5最小n根據要分離物質的相對分子質量選擇合適的單體濃度。n2 不連續電泳中樣品壓縮成層的原理n不連續電泳含兩層或三層不同孔徑的凝膠，用不同pH值的緩沖液：n樣品

5、膠：大孔徑，pH6.76.8Tris-HCl緩沖液n濃縮膠：與樣品膠相同n分離膠：小孔徑，pH8.88.9 Tris-HCl緩沖液n樣品壓縮成層原理：n電極緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸nHCl (解離） Cl ， Cl 泳動速度最快（快離子）nCH2(NH2)COOH (樣品膠、濃縮膠pH6.76.8） CH2(NH2)COO（0.11.0）泳動速度最慢（慢離子）n蛋白質（P）泳動速度介于快慢離子之間n電泳時， Cl 超過P走在最前面，其后形成一個離子濃度較低的低電導區較高電位梯度P和慢離子加速移動P壓縮成層n樣品進入分離膠后，pH為9.5（電泳過程實測）， CH2(NH2)COO增加，

6、泳動速度增大，很快超過P， P在均一的電位梯度和pH條件下分離SDS-凝膠電泳原理n聚丙烯酰胺凝膠系統中加入SDS，P電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關。n加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使P二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開，并結合到P分子上，形成P-SDS，帶上相同密度負電荷，形狀為長橢圓形，短軸一定，長軸長度正比于P分子量。n分離測定：n測分子量（與標準蛋白比較）n鑒定樣品純度（條帶數目）n測定樣品P含量：掃描定量（比色）凝膠電泳的操作要點n1 凝膠制備n2 電極緩沖液n3 樣品處理及加樣n4 電泳n5 染色與固定n6 脫色n7 分析煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質的分離與純

7、化六 等電點聚焦電泳n電泳系統中加進兩性電解質載體，當通已直流電時，兩性電解質載體即形成一個由陽極到陰極連續增高的pH梯度。P進入時，不同的P移動到與其等電點相當的pH位置上，從而使不同等電點的P得以分離。n優點：分辨率高，區帶清晰、窄，加樣部位自由，重現性好，可測定P或多肽的等電點。n缺點：需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發生變性的P。n1 穩定的穩定的pH梯度的形成梯度的形成n2 兩性電解質載體 要求： 由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備（有不同pH范圍的商品兩性電解質載體）n3 支持pH梯度的介質 密度梯度溶液（用于自由電泳） 凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）n4 操作要點 pH梯度支持介質的制備

8、 聚焦電泳 檢測 兩性電解質載體的除去梯度凝膠電泳也通常采用聚丙烯酰胺凝膠，但不是在單一濃度（孔徑）的凝膠上進行，而是形成梯度凝膠。從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為5，底部凝膠濃度為25。凝膠梯度是通過梯度混合器形成的，高濃度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液濃度呈梯度下降，因此在凝膠的頂部孔徑較大，而在凝膠的底部孔徑較小。梯度凝膠電泳也通常加入SDS，并有濃縮膠。電泳過程與SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳基本類似。與單一濃度的凝膠相比，梯度凝膠有幾個優點： 梯度凝膠電泳首先，梯度凝膠比單一濃度凝膠的分離范圍更寬，可以同時分離較大范圍分子量的蛋白質。單一凝膠電泳

9、對于分子量超過其分離范圍的蛋白質，過大或過小，都不能分離。而梯度凝膠孔徑范圍比單一凝膠大，分子量較大的蛋白質可以在凝膠頂部大孔徑部分得到分離，而分子量較小的蛋白質可以在凝膠底部小孔徑部分得到分離，所以分子量較大和較小的蛋白質可以同時得到分離。例如用430的梯度膠可以分離分子量5萬200萬的蛋白質。 另一個優點是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質。電泳過程中，蛋白質在梯度凝膠中遷移，經過的孔徑越來越小，直到凝膠的孔徑不能通透，這樣電泳過程中蛋白質就被濃縮，集中在一個很窄的區帶中。而分子量略小的蛋白質可以遷移得更靠前一些，被集中在略前面的區帶中。由于梯度凝膠孔徑逐步變

10、小，在蛋白質不能通透的孔徑附近對蛋白有濃縮作用，所以電泳后形成很窄的區帶，可以分辨出分子量相差較小的蛋白質。對于太稀的樣品，在電泳過程中可以將樣品分幾次加樣，大小不同的蛋白質分子最終都會滯留在其相應的凝膠孔徑中而得到分離。 可以直接測定天然狀態蛋白質的分子量而不需要解離為亞基，因此這一方法可以與SDS-PAGE測定分子量的方法互為補充。梯度凝膠電泳主要適用于測定球蛋白的分子量，而對纖維蛋白將產生較大的誤差。由于分子量的測定必須是在未知和標準蛋白質分子到達完全被阻止遷移的孔徑時才能成立，因此電泳時要使用較高的電壓，例如平板凝膠為0.5mm厚，使用600V電壓， 50mA電流，電泳時間約需2小時。電泳技術思考題n