1、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué) 2003年16卷03期 267275頁懷牛膝多糖和枸杞多糖在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中非酶轉(zhuǎn)化的抑制作用鄧宏斌，崔大鵬，蔣建明，馮艷春，蔡年生，李殿東藥用生物技術(shù)研究所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京 10050，中國目的：探討懷牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中非酶轉(zhuǎn)化的抑制作用和機理。方法：血清年齡水平是由年齡-酶聯(lián)免疫吸附，MTT法來確定，它們通常用于確定淋巴細胞增殖，IL-2活動由一種生物測定方法決定。自發(fā)活動被用于檢測老鼠的神經(jīng)肌肉活動，延遲的單步調(diào)試的方法被用來檢查小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，比色測定法被用來測定小鼠皮膚中羥脯

2、氨酸的濃度，鄰苯三酚自氧化法用來確定紅細胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果：在小鼠體內(nèi)注入ABP或LBP后，我們發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)血清年齡水平降低，羥脯氨酸在小鼠皮膚中的含量降低和自發(fā)運動活動在右旋半乳糖小鼠衰老模型被檢測到，同時淋巴細胞增殖和IL-2活動、學(xué)習(xí)和記憶能力、紅細胞的SOD活性都增強了。結(jié)論：ABP和LBP能抑制右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中小鼠體內(nèi)非酶轉(zhuǎn)化，ABP比LBP有更好的抑制作用。關(guān)鍵字：懷牛膝多糖（ABP）；枸杞多糖（LBP）；右旋乳糖；非酶轉(zhuǎn)化；老化介紹我們之前的工作表明，給小鼠注射右旋半乳糖可以誘導(dǎo)類似加速老化的變化。老化模型顯示，神經(jīng)損傷會減少抗氧化酶活動，而產(chǎn)生

3、輕微的免疫反應(yīng)，ABP是一種從中國草藥牛膝的根中提取的活性成分。布魯姆的研究表明，ABP能夠加強免疫系統(tǒng)的免疫能力，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，增加白細胞的數(shù)量，從而保護了肝細胞。枸杞多糖（LBP）是一種從枸杞中提取的生物活性物質(zhì)，它可以提升T，B，CTL，NK和M 細胞因子增強受腫瘤痛苦的小鼠和輻照受損小鼠的功能免疫，調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)，本研究的目的在于調(diào)查ABP和LBP在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模型中的效果，包括神經(jīng)活動，血清年齡水平，皮膚羥脯氨酸濃度和自發(fā)運動活動，淋巴細胞核擴散和IL-2活動，學(xué)習(xí)和記憶能力，紅細胞SOD活性。材料和方法受試物懷牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）由袁天根教授，上海有

4、機化學(xué)研究所，中國科學(xué)院提供。藥物應(yīng)該放在含有PBS和濾過0.22um膜的生理鹽水。動物與治療選用三個月大的雌性小鼠C57BL/6J（總共32只，18g22g重，由中國科學(xué)院實驗動物中心提供，CAMS），并隨機分為4組，每組8只小鼠。一周適應(yīng)期后，小鼠們將會進行下列一系列的一個8周的日常治療：1、給第一組的小鼠每只注射0.4ml PBS作為媒介物控制；2、給第二組小鼠每只按50mg/kg注射右旋半乳糖；3、給第三組小鼠每只按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg ABP；4、給第四組小鼠按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg LBP。8周以后，4組小鼠將會被殺死，并及時將它們的血清，

5、器官和組織收集起來，為后面實驗做準備，將它們存儲在-70溫度下。年齡酶聯(lián)免疫吸附測定年齡的定量測定將會由年齡酶聯(lián)免疫吸附法來測定。簡單地說，在96孔板上涂一層3ug/ml AGE-BSA，每孔100ul，放在4涂料緩沖液中過夜。孔板用150ul洗滌液（PBS，0.05二層20,1mmL/L NaN3）沖洗3次，然后再控板上注滿1的正常山羊血清在100ulPBS在37下2小時。經(jīng)過洗滌后，50ul的1:10稀釋血清（樣本）。添加稀釋緩沖液（PBS，0.02二層20,1mmol/L，NaN3，1正常山羊血清)和50ml多克隆抗血清抗年齡在稀釋緩沖液（1:3000）。孔板放在室溫下孵化2小時，并在一

6、個水平旋轉(zhuǎn)搖動床下溫和攪拌。洗凈后，補充100ml堿性磷酸鹽共軛液和抗體稀釋緩沖液（1:2000），把孔板放在37下孵化1小時。孔板要像上述那樣子清洗6次，添加100ul的對硝基苯磷酸液到每一個孔板上。然后在3060分鐘培養(yǎng)后，在光學(xué)密度（OD）405nm下同酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）顯微鏡下觀察讀數(shù)（3550，Bio-Rad）。AEG-BSA被用來作為一種競爭抗原來生成一個標準。樣品的年齡值將由標準曲線來計算。淋巴細胞的增值誘導(dǎo)淋巴細胞增殖實驗 淋巴細胞增殖將會進行一些描述性可接受的改變。動物死后在無菌條件摘除脾臟，細胞懸浮液的摩擦對無菌不銹鋼組織鋼絲網(wǎng)(100um)在10毫升磷酸鹽緩沖

7、液中。污染細胞溶解的紅細胞是治療細胞球放在5毫升三羥甲基氨基甲烷-氨基鹽氯溶解緩沖液（0.1 8摩爾/升 氯化銨在0.1 7摩爾/升 三羥甲基氨基甲烷 pH值7.2)在室溫下放置2分鐘。然后用磷酸緩沖液清洗，脾淋巴細胞是放在100 uL無血清細胞凍存培養(yǎng)基(RPMI) 1640介質(zhì)中在10 6細胞/孔板 有或沒有7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA）。孔板在37下孵化44小時后,，20 uL氯丁膠新型交聯(lián)劑（MTT）(5毫克/毫升)添加到每個孔板和培養(yǎng)基中，在37培養(yǎng)6小時。讀數(shù)在顯微感光版閱讀器(型號3550,生物閱讀)在波長570 nm處。增殖的淋巴細胞被表示為刺激指數(shù)(外直徑OD在57

8、0nm的測試樣品/ OD的570nm非刺激控制淋巴細胞)。IL-2測定 IL-2活動決定使用生物測定,如前面描述的淋巴細胞是在5 x 106細胞培養(yǎng)/毫升24 h與7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA），將其無細胞上清培養(yǎng)液收集起來。重組人類IL-2標準和測試上層清液，用無血清細胞凍存培養(yǎng)液（RPMI）稀釋1640介質(zhì)在96孔微文化板塊(1 00 uL /毫升)，和100 uL的細胞株-2（CTLL-2）細胞(寫明ATCC)在4×105細胞/毫升RPMI 1640培養(yǎng)基中添加到每個孔板。這些細胞在解散深藍色水晶中37下孵化6 h。OD在570nm是由一個顯微感光版讀者和IL-2活動

9、，根據(jù)標準曲線計算，數(shù)據(jù)被表示為U /毫升。自發(fā)運動活動測試 光電管籠的方法應(yīng)用于測試自發(fā)的神經(jīng)活動的老鼠,光電管裝置(XZ-4模型，研究所綱目，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)由四個黑框(19×10厘米)。四光束與相應(yīng)的光電管盒在外圍的自發(fā)運動活動，老鼠被發(fā)現(xiàn)使用一個光電檢測器在結(jié)束治療老鼠被放置進一箱一箱/框。2分鐘適應(yīng)后，自發(fā)活動被記錄了10分鐘的活動，利用磷酸緩沖液治療年輕老鼠被認為是一個標準的100%活動特聘數(shù)據(jù)分析。進一步通過測試獲取內(nèi)存 這個步驟通過方法被用來評估學(xué)習(xí)和記憶的能力，老鼠的試驗裝置(36 x 12×12厘米,MX-5模型，研究所綱目，中醫(yī)學(xué)科學(xué)院)包括兩個隔間:

10、一個黑盒,一盒光照亮高25厘米的頂部室。在兩個框之間有一個直徑3厘米的洞，在最后10天的處理，每個老鼠被放置在照明箱未用頭撞擊孔。當小鼠進入黑暗盒中，一個超足部電擊(30 V,50赫茲)通過整個籠子網(wǎng)格。小鼠要逃離電擊只有退到被照亮的“安全”側(cè)。老鼠被每天訓(xùn)練了5分鐘,進行1 0天記憶測試。在測試后，小鼠被放置到照明箱和延遲時間(以秒計算)和大量的錯誤記憶將會被記錄5分鐘。用磷酸緩沖液處理的小鼠將會被用作對比。羥脯氨酸測定 小鼠死后,皮膚樣品從小鼠后背取。從每個小鼠身上取25mg(干重)的脫脂樣本水解在2毫升 6mmol/L鹽酸中，在140解析6 h。樣本用氫氧化鈉中和，然后溶解在15毫升蒸餾

11、水中。1毫升水解物的解決方案添加下列順序:1毫升氯胺T(1.41%),1毫升3.156 mol / L,1毫升高氯酸試劑(20% p二甲氨基-對羥基苯甲醛)形成發(fā)色團為560 nm標準羥脯氨酸解決方案是用來生成一個標準曲線從15ug /毫升。超氧化物歧化酶(SOD)測定 SOD活性測定紅細胞通過測量抑制鄰苯三酚使用一個先前發(fā)表的自然氧化法與一些修改。焦棓酸解決方案(0.1mmol/ L)準備好了1毫米三鹽酸,pH8.2。一個穩(wěn)定的自氧化速率是達到和變化在325的OD 0.07 /分鐘在房間溫度的一個標準，曲線是由0.1 -0.5 ug /毫升SOD。樣本OD隨后被測量和活動是根據(jù)標準曲線計算。

12、數(shù)據(jù)分析 值被表示為x s。統(tǒng)計學(xué)意義上的差異實驗組織是由學(xué)生的學(xué)習(xí)評價。結(jié)果血清年齡水平與右旋半乳糖小鼠顯示水平增加血清年齡(6.38 + -1.55)而對照組小鼠(2.79 - 0.96)(P < 0.01),治療組小鼠的血清年齡水平加上ABP與右旋半乳糖或LBP,分別為4.27 0.78和5.18 1.14(P < 0.01),分別表明ABP和LBP能防止年齡增加治療的小鼠右旋半乳糖(圖1). 圖1 血清年齡水平的年輕和治療小鼠血清年齡水平所決定的一個數(shù)據(jù)定量年齡酶聯(lián)免疫吸附測定被表示為相對年齡單位/毫升(x + j,n = 8)。p < 001vs年輕,p <

13、001。p < 0.05 VS右旋半乳糖。IL-2生物測定 與右旋半乳糖小鼠表現(xiàn)出明顯降低淋巴細胞增殖(2.08 0.25)和IL一2生產(chǎn)(9.32 1.54)體外相比三月大的對照組(p < 0.0 1)真好與右旋半乳糖小鼠加上ABP或LBP有一個增加淋巴細胞增殖和IL一2生產(chǎn)(p < 0.01),表明下降的免疫反應(yīng)治療的小鼠了右旋半乳糖ABP或LBP和ABP有一個更好的抑制效果比LBP(圖2)。 圖2 淋巴細胞增殖和IL一2生產(chǎn)的年輕和治療的小鼠(A)伴刀豆球蛋白-引誘的(7 ug /毫升)脾淋巴細胞增殖氯丁膠新型交聯(lián)劑（MTT）法刺激指數(shù)計算,:在570的測試樣品OD /

14、 OD在570的非刺激控制。(B)IL一2活動(U /毫升)在伴刀豆球蛋白-治療的脾臟的淋巴細胞是由一個生物測定數(shù)據(jù)被表示為x + s。n = 8,cP < 0.01 vs年輕,P < 0 01 cp < 0.05 vs右旋半乳糖。自發(fā)運動活動運動是由自發(fā)運動活動右旋半乳糖。治療顯著降低小鼠自發(fā)運動活動的年輕人(155 + 45)與對照組比較(282 + 66)(p < 0.0 1),是預(yù)防用真菌性右旋半乳糖，額外的治療ABP或LBP(p < 0.05)(圖3),抑制性能的ABP比LBP的高17.5%。圖3 年輕小鼠的自發(fā)運動活動和治療老鼠。小鼠從不同組中集中起來

15、，放置在光電管籠子和自發(fā)運動活動，記錄電子日期被表示為平均每10分鐘活動(x +年代,n = 8)計算:每組的活動/活動群bp < 0.01VS年輕，aP< 0.05 VS右旋半乳糖。小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力學(xué)習(xí)和記憶能力進行了延遲的單步調(diào)試方法。右旋半乳糖小鼠體內(nèi)顯示減少延遲的步驟通過(130 - 36)(P < 0.0 1)和更多的錯誤試驗(0.74 + 0.47)比試驗縮短延遲時間和增加內(nèi)存錯誤在右旋半乳糖小鼠預(yù)防治療ABP或LBP治療(P < 0.0 1)(圖4)。延遲時間的抑制作用ABP是28.7%高于LBP但錯誤的ABP和LBP治療組兩個低于右旋半乳糖組。羥脯氨

16、酸濃度的皮膚和紅細胞SOD活性用右旋半乳糖治療的年輕小鼠會導(dǎo)致增加皮膚羥脯氨酸內(nèi)容(63.44 + 8.00)和紅細胞SOD活性下降(3.7±1.8)(P < 0.01),而皮膚羥脯氨酸含量和紅細胞SOD活性下降后上升另外治療ABP或LBP,就是說,是預(yù)防的效果。右旋半乳糖從ABP 或LBP中提取(圖5)。討論 非酶轉(zhuǎn)化廣泛被認同作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一種機制關(guān)于糖尿病和糖尿病并發(fā)癥。先前的研究也從我們的實驗室證明先進的糖化機理可以解釋右旋半乳糖衰老模型，已成為一個熱點搜索抑制劑的非酶轉(zhuǎn)化在最近幾年傳統(tǒng)中藥具有二千年歷史的一直被證明是非常有效的養(yǎng)護,這啟發(fā)人和糖尿病,許多研究人員在中國

17、已經(jīng)開始研究抑制作用的中藥在非酶轉(zhuǎn)化一些化合物,如槲皮素,水飛薊素,一直全面研究和顯示抑制效應(yīng)在非酶轉(zhuǎn)化體外和體在這項研究中,我們的結(jié)果表明,治療組ABP或LBP顯著降低血清年齡層次、內(nèi)存延遲時間和錯誤率,和皮膚羥脯氨酸過敏的老鼠也有顯著增加電動機的活動,淋巴細胞增殖,藥物生產(chǎn)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。所有這些結(jié)果表明ABP和LBP是新的中藥可以防止非酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)體內(nèi)。無論是人類和動物，衰老有關(guān)的免疫功能下降。免疫功能的下降與年齡相關(guān)傳染性疾病增加。惡性腫瘤、自身免疫性疾病有絲分裂原誘導(dǎo)淋巴細胞增殖和IL-2生產(chǎn)標記老化。這項調(diào)查的發(fā)現(xiàn),動物治療ABP或LBP顯示增加了與淋巴細胞增殖和IL

18、一2生產(chǎn)支持這可以防止ABP和LBP的下降通過抑制免疫功能非酶轉(zhuǎn)化。圖4 延遲時間和記憶錯誤率的年輕的被治療的小鼠體內(nèi)。步驟通過方法被用來確定延遲時間(A)和記憶錯誤率(B).。每只小鼠是訓(xùn)練了5分鐘先“記住”系統(tǒng)十天后,老鼠被放置在同一個籠子和延遲時間(秒)和錯誤的數(shù)量記錄電子。n = 8，aP<0.01 vs年輕,bp < 0.05 vs右旋半乳糖。 圖5 羥脯氨酸含量和SOD活性在年輕和小鼠體內(nèi)。(A)在皮膚羥脯氨酸濃度的鼠標是由一個比色測定數(shù)據(jù)被表示為x±s(ug /毫克干組織)。(B)草皮活動在紅細胞的測定和數(shù)據(jù)被表示為x±s(100 u/mL血液).

19、 = 8,bp < 0.01 VS年輕的p < 0.01 vs右旋半乳糖。 神經(jīng)系統(tǒng)老化是一個復(fù)雜的過程之前的報告表明：在右旋半乳糖小白鼠那里都是增加的脂褐質(zhì),丙二醛、單胺氧化酶B,和超氧化物歧化酶在大腦、心臟和肝臟,并降低程度的過氧化物歧化酶(SOD)在血清這些更改可能會直接或間接地導(dǎo)致大腦衰老。我們的研究結(jié)果表明,可以防止ABP或LBP下降的神經(jīng)系統(tǒng)函數(shù)通過抑制非酶轉(zhuǎn)化。 自由基方面起著非常重要的關(guān)鍵作用。SOD是一個關(guān)鍵酶在身體的衰老過程中，除老化當身體老化時，身體的本能能力會清除自由基使其含量降低，同時SOD也減少。蛋白質(zhì)會改性由于年齡可能產(chǎn)生大量的自由基，在氧化的超氧化物

20、歧化酶的活性會降低或失去的身體產(chǎn)生的超氧化物歧化酶。在我們研究中，在紅細胞SOD活性活動降低右旋半乳糖可以被ABP或LBP抑制。結(jié)果表明ABP或LBP能夠抑制降低SOD活性和提高能力消除自由基和防止非酶轉(zhuǎn)化。 老化的膠原蛋白交聯(lián)理論認為增加膠原蛋白的交叉-鏈接在老化可能導(dǎo)致減少敏感性對酶和減少膠原蛋白的溶解性，彈性，靈活性。皮膚中的羥脯氨酸含量間接標記為膠原蛋白含量。在這項研究中，增加皮膚中羥脯氨酸含量即右旋半乳糖誘導(dǎo)可以抑制ABP或LBP，結(jié)果表明ABP或LBP可以延遲膠原蛋白衰老通過抑制非酶轉(zhuǎn)化。 從我們的研究結(jié)果我們得出結(jié)論，ABP比LBP有更好的效果在抑制非酶轉(zhuǎn)化方面。那為什么會發(fā)生這

21、種情況呢？是不是有一個共同的機制傳統(tǒng)的中藥多糖在抑制非酶轉(zhuǎn)化？這是一個等待進一步的研究問題。參考文獻1. Song，X.Bao，M.M,Li,D.D,和Li,Y.M.(1999).在右旋半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老模式中的先進糖化.機械老化發(fā)展.108期.241 - 253頁.2.Li,Z.K.D.D.(1997),懷牛膝的免疫調(diào)節(jié)性能.藥學(xué)學(xué)報.32期.881 - 887頁.3.Wang,Y.Zhao,H.Sheng,X,Gambino,P,E,Costello,B,和Bojanowski，K.(2002)保護的性能枸杞多糖對時間和高熱誘導(dǎo)損傷。民族藥物學(xué).82期.169一l75頁.4Mitsuhas

22、hi， T，V1assara，H，F(xiàn)ounds，HW 和Li，YM(1997)使用先進的規(guī)范免疫測定糖化晚期正常的人類血清.寄生蟲病的方法雜志.207期.7988頁.5Denizot，E 和 Lang，R(1986)快速比色測定細胞生長和生存的修改到四唑染色過程給我們證明其敏感性和可靠性。寄生蟲病的方法雜志89期27 1-277頁.6Tlada，H，Shiho，O，Kuroshima，KI，Koyama，M和 Tsukamoto，K(1986)改進的比色測定對白介素一2的影響.寄生蟲病的方法雜志93期157一l65頁.7Sun，CC和 Zhang，SS(1991)比較在顱內(nèi)注射谷氨基酸.天冬氨酸,和紅藻氨基酸的影響.中國藥理學(xué)報.12期.239241頁.8Zhang，JT和 Saito，H(1986)研究的敏感性影響的遺忘的十二化學(xué)品小鼠被動回避反應(yīng):比較下臺和步驟通過測試.藥理學(xué)報2l期.l2一l9頁.9Reddy，GK和 Enwemeka，CS(1996)一個簡化方法分析生物組織中的羥脯氨酸。中華醫(yī)學(xué)總覽29期.225229頁.10Marklund，S和 MarklundG(1974).超氧陰離子自由基的參與在自然氧化的焦棓酸和一個方便的測定方法測超氧化物歧化酶。.生物化學(xué)期刊47期469-47