1、RNA鏈延伸中RNA聚合酶對(duì)信息的加工明鎮(zhèn)寰 摘要：本文在簡(jiǎn)述了轉(zhuǎn)錄循環(huán)和轉(zhuǎn)錄中間體、尤其是轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，就RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄延伸中的作用作了綜述。RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作出抉擇依賴于對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物內(nèi)在的或外來的信息輸入，其功能在很大程度上都像是一個(gè)信息加工者。 關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物；RNA聚合酶；信息加工 中圖分類號(hào)： Q756文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 02539772(2000)01004750 Information Processing by RNA Polymerase During RNA Chain Elongation MING Zhen huan (Co

2、llege of Life Science，Zhejiang University,Hangzhou 310028,China) Abstract: It is reviewed for the function of RNA polymerase during transcription elongation based on the description of transcription cycle and the structure of transcription intermediates,especially, the transcription elogation comple

3、x. The decision of RNA polymerase for transcriptional regulation depends on the intrinsic or extrinsic imputs of information to transcription elongation complex. Thus, the function of RNA polymerase looks like an information processor to a great extent. Key word: Transcription elongation complex; RN

4、A polymerase; Information processor 于所有可接近的位置6。沿著DNA鏈定向移位的能量是由核苷酸的加入造成TEC構(gòu)象改變所衍生的。也有可能RNA聚合酶是一種“機(jī)械酶”(mechano enzyme)，其通常保持與RNA和DNA的緊密接觸并使用磷酸二酯鍵水解的能量產(chǎn)生內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)7。 停滯(arrest)、暫停和終止。在某些位點(diǎn)，核苷酸的加入因暫停、停滯和終止信號(hào)而放慢，所以RNA鏈的延伸被不時(shí)打斷。暫停信號(hào)引起RNA聚合酶從快速延伸的TEC狀態(tài)異構(gòu)化而改變其構(gòu)象。在這種構(gòu)象下，RNA鏈的延伸被可逆地抑制。停滯信號(hào)只在體外試驗(yàn)中檢測(cè)到，能不可逆地阻斷RNA鏈的延伸

5、。暫停和停滯可能反映了TEC在結(jié)構(gòu)上的不同改變，終止信號(hào)引起RNA和DNA鏈的釋出。 有幾種類型的暫停轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，其由不同的內(nèi)在的或外來的相互作用所調(diào)節(jié)。某些停頓僅與DNA序列有關(guān)而無需別的調(diào)節(jié)物，而有些暫停信號(hào)則是特定的調(diào)節(jié)中間物，它們能阻止轉(zhuǎn)錄超出某一區(qū)域。處于大腸桿菌和沙門氏菌的氨基酸生物合成操縱子前導(dǎo)區(qū)中部的依賴于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的暫停位點(diǎn)即屬于后者。這些位點(diǎn)使RNA聚合酶停止前進(jìn)直至核糖體起始前導(dǎo)肽的合成，或者直到最終自發(fā)地逃逸并導(dǎo)致超衰減(superattenuation)。通過放慢RNA鏈延伸以允許TEC在結(jié)構(gòu)上的調(diào)整，暫?？磥硎菍?dǎo)向停滯和終止的一個(gè)起始步驟。暫停位點(diǎn)的存在有利于對(duì)缺陷的

6、mRNA進(jìn)行監(jiān)視。在暫停位點(diǎn)放慢速度的RNA聚合酶或被翻譯著的核糖體所釋放，或者被終止因子所釋放8。如果把RNA聚合酶比作信息加工者，暫停信號(hào)則指示其停下來等待調(diào)節(jié)信號(hào)的輸入。 當(dāng)RNA聚合酶遇到終止信號(hào)時(shí)，其停止往RNA鏈上加入新的核苷酸，解開DNA-RNA雜交鏈，釋放出新合成的轉(zhuǎn)錄物，自身也從DNA模板上解離下來。 2轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物的結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物是整個(gè)轉(zhuǎn)錄循環(huán)中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄中間體，與轉(zhuǎn)錄循環(huán)中其它階段的轉(zhuǎn)錄中間體一樣，RNA聚合酶通過其與DNA、RNA和蛋白因子及其它因子的相互作用，以一種特定的空間構(gòu)象，在RNA鏈延伸中起著接受信息輸入和作出相關(guān)轉(zhuǎn)錄決定的信息加工者的作用。 2.

7、1RNA聚合酶的三維結(jié)構(gòu) Kornberg等人運(yùn)用電子晶體學(xué)的方法，已經(jīng)獲得了低分辨率的E.coli RNA聚合酶全酶和核心酶及酵母RNA聚合酶和的三維結(jié)構(gòu)9,10,11，表明可能所有的RNA聚合酶都具有一些共同的特點(diǎn)：(1)在其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)寬度約為25埃的槽，在從RNA聚合酶與起始因子復(fù)合物向TEC的轉(zhuǎn)變中處于緊鄰下游雙鏈DNA處；(2)結(jié)構(gòu)上有一些適于跟ssRNA和DNA接觸的特點(diǎn)；(3)兩個(gè)幾乎橫貫RNA聚合酶的通道，其中一個(gè)作為RNA鏈的出口。整個(gè)結(jié)構(gòu)與DNA聚合酶的手狀結(jié)構(gòu)基序(hand-like motif)相似。 2.2TEC中的相互作用 在RNA鏈延伸中的RNA聚合酶由、和亞基

8、的二體所組成，在所有已知的RNA聚合酶中亞基和亞基均十分相似。和在延伸中對(duì)與DNA、RNA的接觸起主要作用,并決定酶的活性。這種相互作用影響暫停和終止12,13。RNA聚合酶也與幾種金屬離子結(jié)合，其中兩個(gè)鋅離子結(jié)合酶的和亞基，兩個(gè)或多個(gè)鎂離子為酶充分發(fā)揮活性所需。在TEC中關(guān)鍵的相互接觸可能發(fā)生在和這兩個(gè)亞基的界面上14。 3RNA聚合酶：轉(zhuǎn)錄信息的加工者 RNA聚合酶在發(fā)揮其功能時(shí)，沿著DNA鏈移動(dòng)，從DNA鏈上識(shí)讀信息，將其翻譯到新生的RNA鏈上。很像第一代理論計(jì)算機(jī)，通過重復(fù)的邏輯操作進(jìn)行其運(yùn)算。RNA聚合酶可以從新生的RNA鏈獲得反饋的信息來決定選擇新的起始位點(diǎn)，并對(duì)暫停及終止信號(hào)作出

9、反應(yīng)。RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作出抉擇依賴于對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物的兩種類型的信息輸入：內(nèi)在的(intrinsic)輸入和外來的(extrinsic)輸入。在這里，內(nèi)在的輸入指那些能與RNA聚合酶發(fā)生相互作用的RNA和DNA的特定序列。這種相互作用的結(jié)果產(chǎn)生不同構(gòu)象的TEC，從而影響RNA鏈的延伸，或使其快速轉(zhuǎn)錄，或使其停頓以至于終止轉(zhuǎn)錄。而且這些不同構(gòu)象的TEC還是各種能增強(qiáng)或抑制RNA鏈延伸或終止的外來輸入的靶目標(biāo)。內(nèi)在的或外來的輸入信號(hào)或是些小分子物質(zhì)，或是蛋白質(zhì)及其它RNA分子。它們通過與RNA聚合酶直接接觸或通過與RNA或DNA的接觸，能與TEC相互作用并調(diào)節(jié)其活性。表1例舉了這些輸入及其作

10、用的靶目標(biāo)和功能。TEC的不同構(gòu)象和上述各種不同的輸入為轉(zhuǎn)錄加工提供了極大的調(diào)節(jié)靈活性。 圖1轉(zhuǎn)錄循環(huán) 4內(nèi)在的輸入 有多重的內(nèi)在輸入控制著RNA鏈的延伸，它們包括：活化部位，下游DNA雙鏈，非模板DNA鏈，RNADNA雜交物，RNA轉(zhuǎn)錄物的出口和新生RNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 4.1活化部位 RNA聚合酶的活性部位催化新生RNA鏈3末端氧原子與NTP 焦磷酸間的親核置換反應(yīng)15。二價(jià)鎂離子在催化反應(yīng)中通過配位鍵使底物處于一種特定結(jié)構(gòu)的過渡態(tài)而發(fā)揮作用。RNA鏈3末端和NTP在活性部位的定位決定了由TEC作出的大多數(shù)調(diào)節(jié)抉擇。不正確的定位會(huì)抑制核苷酸加入新生RNA鏈。活性部位外起調(diào)節(jié)功能的相互作用可能

11、最終通過活性部位內(nèi)的相互作用而對(duì)RNA鏈的延伸發(fā)揮作用。 4.2下游DNA雙鏈 指活性部位下游的約18bp的雙鏈DNA。其序列至少影響對(duì)某些暫停位點(diǎn)和終止子的識(shí)別16。該序列與RNA 1 2301 272(亞基的第1 230個(gè)殘基至第1 272個(gè)殘基)和30102殘基交聯(lián)。這種相互作用為TEC提供了抗鹽性。亞基的類鋅指基序中Cys殘基被Ala的替代會(huì)引起TEC在剛起始后即不加選擇地終止?？磥?，RNA聚合酶和亞基中的這些片段與下游DNA的鎖狀(clamp)結(jié)構(gòu)有關(guān)。它們間的相互作用使RNA聚合酶和DNA鏈保持相互接觸。 4.3非模板DNA 在解開的DNA鏈中，非模板鏈位于RNA聚合酶的外部。其堿

12、基暴露，易于被核酸酶接近。隨著DNA鏈的移位，它又會(huì)與模板鏈重新進(jìn)行堿基配對(duì)。這種轉(zhuǎn)錄泡的推進(jìn)幾乎是等能量地進(jìn)行的17。非模板鏈暴露的堿基是調(diào)節(jié)因子相互作用的一個(gè)誘人的靶目標(biāo)。Ring等人最近報(bào)道，在晚期操縱16位上，由于因子對(duì)非模板鏈DNA的結(jié)合，造成了啟動(dòng)子近側(cè)的暫停18。 4.4RNADNA雜交物 關(guān)于RNADNA雜交物的長度和作用是轉(zhuǎn)錄研究中熱烈爭(zhēng)論過的問題?；赗NA足跡法的一個(gè)模型認(rèn)為，TEC中大約存在12bp的RNADNA雜交物。這個(gè)結(jié)論與熱力學(xué)分析結(jié)合導(dǎo)致Yager等人假設(shè)12bp的雜交物從能量上補(bǔ)償了融解的DNA泡形成穩(wěn)定的TEC19。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的介入導(dǎo)致的雜交減弱會(huì)使TEC不

13、穩(wěn)定和發(fā)生解離。但另一種模型則認(rèn)為，雜交物的長度不是TEC穩(wěn)定的主要原因，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)表明，用RNase降解而留下只有23個(gè)bp的雜交物并未造成延伸能力的喪失。 4.5RNA轉(zhuǎn)錄物的出口 在TEC中，RNADNA雜交物上游的單鏈RNA能與RNA聚合酶的亞基(904905)和亞基(181)發(fā)生相互作用，新生的RNA鏈通過RNA聚合酶結(jié)構(gòu)中的一個(gè)通道從TEC中逸出。實(shí)驗(yàn)表明，新生RNA進(jìn)入這個(gè)出口為TEC提供了穩(wěn)定，可能是其引發(fā)了下游DNA鎖狀結(jié)構(gòu)的關(guān)閉。 4.6新生RNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄物從TEC中出來后形成的RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)是某些暫停信號(hào)組成的必要部分，也是不依賴于因子的終止子所要求的。它們能引起

14、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的解離；RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)還能作為反終止子發(fā)揮作用。發(fā)夾結(jié)構(gòu)如何調(diào)節(jié)RNA鏈生長的關(guān)鍵問題是：它們是通過與RNA聚合酶的直接接觸發(fā)揮作用還是間接地通過干擾ssRNA與RNA聚合酶或DNA的相互作用而發(fā)揮作用。幾方面的證據(jù)表明在暫停和終止中，RNA發(fā)夾與RNA聚合酶傾向于發(fā)生直接的相互作用20,21。 表1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與信息輸入 信息輸入 靶目標(biāo) 作用 內(nèi)在的輸入 新的RNA結(jié)構(gòu) RNA聚合酶 暫停、終止 RNA 終止 RNA近3端區(qū) RNA聚合酶 暫停（1011）nt/終止（富含U的79）nt/停滯（富含U） C模板DNA鏈 RNA近3端區(qū)、RNA聚合酶 ？ 非模板DNA鏈 Sigma因子

15、、RNA聚合酶 暫停 活化部位堿基 RNA聚合酶 暫停 下游DNA雙鏈 N端鋅指、C端區(qū) 暫停、終止 外來的輸入 非模板DNA鏈 暫停 新生RNA、RNA聚合酶？ 終止 不詳 終止 ppGpp 不詳 暫停 NusA C端區(qū)、或、RNA發(fā)夾 暫停、終止、反終止 NusB 新生RNA鏈的BoxA 反終止 NusE 新生RNA鏈的BoxA 反終止 NusG RNA聚合酶 暫停、終止 GreA RNA聚合酶、新生RNA 轉(zhuǎn)錄切割、反停滯、啟動(dòng)子逃逸 GreB RNA聚合酶、新生RNA 轉(zhuǎn)錄切割、反停滯、啟動(dòng)子逃逸 基因特異調(diào)節(jié)物 RNA聚合酶、DNA或新生RNA 多種 5外來的輸入 RNA聚合酶和RN

16、A或DNA的相互作用能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的不同構(gòu)象，這些構(gòu)象能作為外來因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)的靶目標(biāo)。這些外來因子能修飾RNA聚合酶對(duì)進(jìn)一步的內(nèi)在輸入反應(yīng)的規(guī)則，類似于早期計(jì)算機(jī)裝置中依賴信息輸入造成邏輯規(guī)則變化。對(duì)這些外來輸入作用理解的關(guān)鍵在于解釋它們是如何改變RNA、DNA和NTPs與RNAP的內(nèi)在相互作用以及改變其酶學(xué)特性的。外來因子NusA對(duì)暫停和終止的影響是一個(gè)很好的例證22。NusA是作為噬菌體依賴于N的反終止現(xiàn)象中必需的細(xì)胞因子而發(fā)現(xiàn)的。但是發(fā)現(xiàn)在所有已被測(cè)序的原核生物和古核生物中，在其它細(xì)胞或噬菌體蛋白缺失的情況下能增強(qiáng)暫停和不依賴于因子的轉(zhuǎn)錄。NusA是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為55kDa 1

17、Da=1u(原子質(zhì)量單位)的酸性蛋白質(zhì)，其能與因子、N蛋白和RNA相互作用，也能與RNA聚合酶通過與亞基C端結(jié)構(gòu)域或亞基及亞基的接觸相互作用。其競(jìng)爭(zhēng)NTP的結(jié)合和以一種位點(diǎn)特異的、可能涉及與RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用的方式增強(qiáng)暫停。其穩(wěn)定暫停中間物是通過進(jìn)一步穩(wěn)定RNA發(fā)夾與RNA聚合酶的相互作用來實(shí)現(xiàn)，還是直接影響RNA 3末端定位都有待于進(jìn)一步研究。 作者簡(jiǎn)介:明鎮(zhèn)寰，男，54歲，碩士學(xué)位，副教授，專業(yè)方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)。 明鎮(zhèn)寰（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州310028） 參 考 文 獻(xiàn)： 1Roe J,Burgess R,Record M.Temperature dependence of

18、 the rate constants of the E.coli RNA polymerase lambda PR promoter interactionJ.J Mol Biol,1985,184:441453. 2deHaseth P,Zupanic M,Record Jr M.RNA polymerase promoter interaction the comings and goings of RNA polymeraseJ.J Bacteriol, 1998,180:30193025. 3Feng G, Lee D N, Wang D, Chan C L,Landick R.Gr

19、eAinduced transcript cleavage in transcription complexes containing E.coli RNA polymerase is controlled by multiple factors,including nascent transcript location and structureJ.J Biol Chem,1994,269:22282 22294. 4Hsu L,Vo N,Chamberlin M.E.coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promo

20、ter escape and gene expression in vivo and in vitro J.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:1158811592. 5Landick R.RNA polymerase slides home:pause and termination site recognitionJ.Cell,1997,88:741744. 6Guajardo R,Sousa R.A model for the mechanism of polymerase trans locationJ.J Mol Biol,1997,265:819. 7Ge

21、lles J,Landick R.RNA polymerase as a molecular motorJ.Cell,1998,93:1316. 8Landick R,Carey J,Yanofsky C.Translation activates the paused transcription complex and restores transcription of the trp operon leader regionJ.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:46634667. 9Darst S A,Edwards A M,Kubalek E W,Kornbe

22、rg R D.Threedimen sional structure of yeast RNA polymerase at 16 A resolutionJ. Cell,1991,66:121128. 10Darst S A,Kubalek E W,Kornberg R D.Threedimentional structure of E.coli RNA polymerase holoenzyme determined by eletron crystallographyJ.Nature,1989,340:730732. 11Polyakov A,Severinova E,Darst S.Th

23、reedimentional structure of E.coli RNA polymerase:promoter binding and elongation conformations of the enzymeJ.Cell,1995,83:365373. 12Jin D J,Walter W A,Gross C A.Characterization of the termination phenotypes of rifampicinresistant mutantsJ.J Mol Biol,1988,202:245253. 13Tavromina P,Landick R,Gross

24、C.Isolation and characterization of defective E.coli RNA polymerase rpoB mutationsJ. J Bacteriol, 1996,178:52635371. 14Landick R,Roberts J.The shrewd grasp of RNA polymeraseJ. Science,1996,273:202203. 15Erie D A,Yager T D,von Hippel P H.The singlenucleotide addition cycle in transcription:a biophysi

25、cal and biochemical perspectiveJ.Annu Rev Biophys Biomol Struct,1992,21:379415. 16Lee D N,Phung L,Stewart J,landick R.Transcription pausing by E.coli RNA polymerase is modulated by downstream DNA sequencesJ.J Biol Chem,1990,265:1514515153. 17Wang D,Landick R.Nuclease cleavage of the upstream half of the nontemplate strand DNA in an E.coli transcription elongation complex causes upstream translocation and transcriptional arrestJ.J Biol Chem,1997,272:598