1、如文檔對你有用，請下載支持!慢病毒包裝系統簡介及應用一、慢病毒包裝簡介及其用途慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。

2、由于有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體，然后轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA,在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶出啟動子來指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶出有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶polyA尾。當RNA聚合酶出遇到連續4個或5個T時，它指導的轉錄就會停止

3、，在轉錄產物3'端形成14個U。U6和H1RNA啟動子是兩種RNA聚合酶出依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉錄區的上游，適合于表達21ntRNA和50ntRNA莖環結構(stemloop)。在siRNA表達載體中，構成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉錄，然后兩條鏈互補結合形成siRNA;也可由載體直接表達小發卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA)，載體包含位于RNA聚合酶出啟動子和45T轉錄終止位點之間的莖環結構序列，轉錄后即可折疊成具有14個U3'突出端的莖環結構，在細胞內進一步加工成siRNA。構建載體前通常要通過合成siRNA的

4、方法，尋找高效的siRNA,然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。慢病毒載體(Lentiviralvector)較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA,實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝R

5、NA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。二、這一系統的目的，主要是為了解決以下問題：1 .對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi,cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。2 .進行穩轉細胞株的篩選；3 .為活體動物

6、模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液；在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。三、慢病毒載體介紹慢病毒載體（Lentiviralvector,LVs）是在HIV-1病毒基礎上改造而成的病毒載體系統，它能高效的將目的基因（或RNAi）導入動物和人的原代細胞或細胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA,其基因組進入細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉錄酶反轉為DNA,形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄mRNA,回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產生RN

7、Ai干擾。慢病毒載體介導的基因表達或RNAi干擾作用持續且穩定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關病毒載體、只整合分裂細胞的傳統逆轉錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻研究表明，慢病毒載體介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝臟、肌肉、視網膜、造血干細胞、骨髓間充質干細胞、巨噬細胞等。慢病毒載體不表達任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位無細胞免疫反應，體液免疫反應也較低，不影響病毒載體的第2次注射。四、慢病毒載體的構建1 .構

8、建原理慢病毒屬于逆轉錄病毒科，但其基因組結構復雜，除gag、pol和env這3個和單純逆轉錄病毒相似的結構基因外，還包括4個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu和2個調節基因tat和rev。HIV21是慢病毒中最具特征性的病毒，第一個慢病毒載體系統即以此病毒為基礎進行構建的。慢病毒載體的構建原理就是將HIV21基因組中的順式作用元件（如包裝信號、長末端重復序列）和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體系統包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV21基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含有包裝、逆轉錄和整合所需的HI

9、V21順式作用序列。同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產生有復制能力的病毒（RCV）的可能性，將包裝成分的5'LTR換成巨細胞病毒（CMV）立即早期啟動子，3'LTR換成SV40polyA位點等。將包裝成分分別構建在兩個質粒上，即一個表達gag和pol、另一個表達env。根據這個原理，Naldini和Kafri等構建了三質粒表達系統。2 .三質粒表達系統三質粒表達系統包括包裝質粒、包膜蛋白質粒和轉移質粒。其中包裝質粒在CMV啟動子的控制下，表達HIV21復制所需的全部反式激活蛋白，但不產生病毒包膜蛋白及輔助蛋白vpu;包膜蛋白質

10、粒編碼水泡性口炎病毒G蛋白（VSV2G）,應用VSV2G包膜的假構型慢病毒載體擴大了載體的靶細胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩定性，允許通過高速離心對載體進行濃縮，提高了滴度；轉移質粒中除含有包裝、逆轉錄及整合所需的順式序列，還保留350bp的gag和RRE,并在其中插入目的基因或標志基因（綠色熒光蛋白GFP）。將載體系統分成三個質粒最大的益處是使序列重疊的機會大大減少，減少載體重組過程中產生RCV的可能性。通過三質粒共轉染293T細胞，超速離心后病毒滴度可達109IU/ml。3 .四質粒表達系統為了減少HIV21包裝結構的序列同源性，進一步減少重組成RCV的可能性，Dull等人將輔助基因去除。但由于gag2Pol的轉運需要rev,因此，在上述的三質粒系統的基礎上，構建成四質粒表達系統，該系統加上含rev的質粒減少了產生RCV的可能性，而且對非分裂期細胞轉導效率無影響。五、慢病毒載體應用1 .將目的基因/RNAi基因轉入難以轉染的細胞，比如神經元細胞、干細胞或其