1、分析與檢測基質固相分散 液相色譜法測定血豆腐中的激素周建科 , 宋歌 , 張明翠 , 劉瑞英(河北大學理化 分析中心 , 河北省分析科學技術重點實驗室 , 河北 保定 , 071002摘 要 采用基質固相分散 樣品前處理方法 , 高效液相色 譜同時測 定血豆腐 中雌三 醇 、 諾 龍 、 甲基睪丸 酮 、 己烯 雌酚 4種激素 。 考察了分散劑種類 、 樣品與分散劑質量比 、 洗脫劑 及洗脫體積對測定結果的影響 。 色譜條件為 :D i kmaC 18柱 (5 m, 250mm 4 6mm i d , 流動相為 V (甲醇 V (四氫呋喃 V (水 =60 10 30。 4組分線 性相 關系數

2、為 0 9998-0 9999。 樣品檢出限為 0 025-0 1 g /g (S /N=3, 回收率 83 0%-94 0%。 關鍵詞 基質固相分散 , 液相色譜 , 血 豆腐 , 激素第一作者 :學士 , 研究員。收稿日期 :2009-06-22, 改回日期 :2009-09-15蛋白同化激素是具有性激素活性的同化劑 , 它能夠促進動物生長 , 在特定的飼喂期間可引起蛋白質沉 積 , 從而提高飼料轉化率。 20世紀 70年代以前 , 許 多國家和地區均將其用作畜禽的促生長劑。但毒理 研究表明這些藥物可能誘發癌癥 , 干擾生殖系統、 神 經系統、 免疫系統1-2。包括我國在內的絕大多數國家已

3、禁止將蛋白同化激 素用作動 物促生 長劑 3-7。若非法將這類藥物用于畜禽、 水產養殖 , 導致藥物在 動物體內及動物性食品中的殘留 , 將危害人類健康。 因此 , 快速有效的檢測動物源食品中蛋白同化激素殘 留量很有必要。血豆腐是人們日常食用的大眾食品 , 有關血豆腐中蛋白同化激素的測定尚未見報道。本 文采用基質固相分散技術處理樣品 , 高效液相色譜檢 測血豆腐中的雌三醇、 諾龍、 甲基睪丸酮、 己烯雌酚 4種蛋白同化激素 , 效果良好。1 實驗部分1 1 儀器與試劑LC 10AT 高效 液 相 色 譜 儀 (日 本 島 津 公 司 , SPD 10A 紫外檢測 器 ; 7725i 型 手動

4、進樣 閥 , N 2000雙通道 色譜 工作 站 (浙 江 大學 智能 信 息工 程研 究 所 , UV 265紫外可見分光光度計 (日本島津公司 。雌三醇、 諾龍、 甲基睪丸酮標準品 (S i g m a 公司 ; 己烯雌酚標準品 (Acros O rganics 公司 ; 四氫呋喃、 甲 醇、 乙醇均為色譜純 ; 二次去離 子水 ; 血豆 腐購自超 市。1 2 色譜條件色譜柱 :D i k m a C 18柱 (5 m, 250mm 4 6mmi d ; 流動相 :V(甲醇 V (四氫呋喃 V (水 =6010 30; 流 速 :1 0mL /mi n ; 檢 測波 長 :雌 三醇 280

5、nm , 諾龍、 甲基睪丸酮、 己烯雌酚 241nm; 柱溫 :室溫 ; 進樣量 :20 L 。采用色譜峰的保留時間定性 , 外標法 峰面積定量。 1 3 標準溶液配制準確稱取雌三醇、 諾龍、 甲基睪丸酮、 己烯雌酚標 準品各 2 0m g , 用乙醇配制成質量濃度為 1 0m g /mL標準儲備液 , 4! 冰箱存放。標準工作溶液 :用乙醇逐 級稀釋標準儲備液。 1 4 樣品預處理準確稱取 1 0g 樣品和 2 0g 分散劑 , 放入研缽 , 輕輕研磨 , 將研磨好的混合物裝填到可加壓磨口玻璃 層析柱中 , 柱底和柱頂均加一圓形濾紙片 , 用注射器 塞輕壓使裝填緊密。先用 4mL 二次水沖洗

6、 , 去除其 中的水溶性物質 , 再用 4mL 正己烷沖洗 , 去除其中的 脂溶性物質 , 最后用 8 0mL 甲醇洗脫目標化合物 , 收 集洗脫液過 0 45 m 濾膜 , 濾液置 40! 水浴 , 氮氣流 吹至 0 2mL , 取濃縮液 20 L 進樣分析。2 結果與討論2 1 色譜條件優化用 UV 265紫外 分光光度計分 別對 4組 分進行 光譜掃描 , 由光譜圖可知 , 雌三醇在 280n m 有強吸收 峰 ; 諾龍、 甲基睪丸酮和己烯雌酚在 241n m 有強吸收 峰 ; 故采用波長時間程序設定檢 測波長為前 5m i n , 280n m, 5m i n 后 241nm 。在等度

7、洗脫條件下 , 分別 考察了甲醇 水 體系和甲醇 四氫呋喃 水 體系作為流 動相的情況。結果顯示 , 用甲醇 水體系作流動相時 , 出峰時間較晚且峰形不好 , 用甲醇 四氫呋喃 水體系 作為流動相 , 4組分分離良好。如圖 1所示。 食品與發酵工業F OOD AND FERMENTAT I ON I N DU ST R IES 1-雌三醇 , 2-諾龍 , 3-甲基睪丸酮 , 4-己烯雌酚圖 1 標準品色譜圖2 2 分散劑及用量確定 考察了中性氧化鋁、 紅色硅藻土、 2種 Florisil 作 分散劑的情況。結果表明 , 中性氧化鋁對被分析物吸 附作用強 , 回收率差 ; 國產 Florisi

8、l 和紅色硅藻土凈化效果不佳 , 雜峰多 , 干擾嚴重 ; 進口 F l o risil 雜峰少干 擾小 , 回收率較 好 , 因 此選用 進口 F l o risil 作為 分散 劑。實驗中考察了分散劑與樣品質量比分別為 1 1、 2 1、 3 1的情況。 2 1時回收率最高 , 故本實驗選擇 分散劑與樣品質量比為 2 1。 2 3 洗脫劑和洗脫體積的選擇考察了甲醇、 乙醇及二 氯甲烷作為洗脫劑的情 況 , 通過比較發現 , 二氯甲烷雜質峰較多 , 影響組分峰 的測定 , 甲醇回收率低 , 乙醇回收率高且沒有干擾 , 因 此選用乙醇作為洗脫劑。 洗脫劑用量對洗脫效率有較大影響。增加洗脫 體積

9、有利于回收率的提高 , 但洗脫體積過大會稀釋被 測組分 , 增加濃縮時間 , 浪費溶劑 , 污染環境。實驗考 察了不同淋洗體積與回收率的關系。結果顯示甲醇 體積為 8m L 時 , 回收率最高。 2 4 線性方程及檢出限移取適量儲備液混合后逐級稀釋 , 配成一系列濃 度的工作溶液。在所選條件下 , 以峰面積對質量濃度 繪制工作曲線 , 線性方程及相關系數見表 1。 4組分 的方法檢出限分別為 0 1、 0 025、 0 05、 0 05 g /g。表 1 線性方程組分 測定范圍 /(mg L -1線性方程R 雌三醇 0 05-250 0Y =2 16665E6X -211 130 9998諾龍

10、 0 005-25 0Y =1 2211E7X +2405 00 9999甲基睪丸酮 0 01-50 0Y =1 55862E7X -619 740 9999己烯雌酚0 01-50 0Y =2 17632E7X +196 110 99982 6 回收率與精密度1 0g 血豆腐中加入適量雌三醇、 諾龍、 甲基睪丸 酮、 己烯雌酚的混合標準溶液 , 按照 1 4處理樣品 , 在 優化的色譜條件下 , 分別測定樣品的本底值和加標后 的含量 , 平行 6次 , 回收率見表 2。樣 品加標色譜圖 見圖 2。表 2 回收率 (n =6組分 本底 /( g g -1加入量 /( g g -1測得量 /( g

11、 g -1回收率 /%雌三醇 010 08. 9489. 4諾龍01 00. 9494. 0甲基睪丸酮 02 01. 7487. 0己烯雌酚2 01. 6683. 01-雌三醇 , 2-諾龍 , 3-甲基睪丸酮 , 4-己烯雌酚圖 2 樣品加標色譜圖2 7 樣品測定在優化的色譜條件下對市售血豆腐樣品進行了 測定 , 雌三醇、 諾龍、 甲基睪丸酮、 己烯雌酚均未被檢 出。樣品色譜圖見圖 3。1-雌三醇 , 2-諾龍 , 3-甲基睪丸酮 , 4-己烯雌酚圖 3 樣品色譜圖3 結論采用本方法測定血豆腐中的雌三醇、 諾龍、 甲基 睪丸酮、 己烯雌酚 4種 蛋白同化激素 , 方法簡便、 快 速、 重現性

12、好、 有較 好的回收率 , 適合常規樣 品的檢 測。本方法能滿足對血豆腐中蛋白同化激素進行監 控的需要。 分析與檢測參 考 文 獻1 李端 藥理學 M(第 5版 北京 :人民衛生出版社 ,2006:293-3072 雷忻 , 李東升 , 張育輝 淺談環 境化學 污染物 的雌激 素效應 -環境雌激素 J 延安大 學學報 (自 然科學版 , 2002, 21(1 :56-583 Sauer M J , Sa m ue ls T P W, H owe lls L G, e t a l R esi duesand m etabo li s m of 19-nortest o ste rone laur

13、ate i n stee rs J.The A na l y st , 1998, 123:2653-26604 M cEvoy J D G, M c V e i gh C E, M cCaughey W J R esi duesof no rtesto sterone esters at i njecti on sites Part 1 O ra l b i o ava il abilityJ The A na lyst , 1998, 123:2475-2478 5 M cEvoy J D G, M c V ei gh C E , M cCaughey W J R esi duesof n

14、ortestosterone esters at i njecti on sites Part 2 Behav i oura l effectsJ T he A nalyst , 1998, 123:2479-2484 6 W alshe M, O K ' eeffe M, L e B izec B Stud i es on the dete rm i nati on of ch l orotestosterone and its m etabo li tes i n bov i ne ur i neJ T he Ana l yst , 1998, 123:2687-2691 7 農業

15、部、 衛生部 、 國 家藥品 監督管理 局 農 業部 176號公告 B 禁止 在飼 料和 動物 飲用 水中 使用 的藥 物品 種目錄 , 2001D eter m i nati on of H or m ones i n the B l ood B ea m Curd byH igh Perfor mance L iqui d Chro m atography Zhou Ji anke , Song G e , Zhang M i ngcu, i L i u Ru i y i ng(R esea rch Cen ter o f P hysics and Che m istry A nalysi

16、s , K ey Labo ra tory o f A na l y ti ca l Sc i ence andT echno logy of H ebe i P rov i nce , H ebei U niversity , Baod i ng 071002, Ch i naABSTRACT M atrix so li d phase d ispersi o n h igh perfor m ance liqu i d chro m atographic (MSPD H PLC m ethod w asused for the si m ultaneous deter m inati o

17、n o f four hor m ones in the blood bea m curd sa mp le , i n clud i n g estrio, l noret h i n drone , m et h y ltestoster on and diethy lstilbestro. l Para m eters such as the k i n d of dispersan, t the w e i g h t ratio o f disper sant and sa m ple , the k i n d and volum e of eluentw ere stud ied

18、 and opti m ized . D ik m a C18co l u m n (5 m, 250mm 4. 6mm . i d . w as used for separation o f the target co m pounds . M ob il phase w as 60 10 30(v /v/vm ethanol tetra hydr o furan w ater . The flo w rate w as 1. 0mL /min and t h e w ave leng t h s ofUV detector w ere 280nm and 241nm . The line

19、ar corre lation coefficient of the four hor m ones w ere 0. 9998-0. 9999. The detection li m its o f the four hor m ones w ere 0. 025-0. 1 g /g. The average recovery o f the co m pounds ranged fro m 82. 9%to 93. 7%.K ey words m atrix so li d phase d ispersion, li q u i d chro m atog raphy , blood bea m curd , hor m ones政 策 法 規 標準 2010年 6月 1日起食品標識要符合新修改的 #食品標識管理規定 質檢總局對 #食品標識管理規 定 進行了新的修訂 , 食品生產者在 2010年 6月 1日前生 產加工的食 品可以繼續 使 用符合原規定要求的原有標 識包裝 , 自 2010年 6月 1日 起 , 食品標 識內 容和形 式要 符合新 修改 的 #食品 標識 管理 規定 。國家質檢總局網 站 11月 12日消息 , #食品標識管理規定 (總局第 102號 令 于 2007年 8