1、多肽介導的核酸藥物遞送系統研究進展丁曉然，王升啟*(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京?100850)摘要 核酸藥物作為新型基因治療藥物備受關注，但生物學穩定性差、易被體內核酸酶降解、生物利用度低、靶組織內聚集濃度低等是制約其發展的主要因素。新的藥物遞送技術的快速發展在一定程度上解決了核酸藥物的穩定性及靶向遞送問題，極大地推動了核酸藥物的研發進展。尤其是多肽蛋白類遞送載體，已成為核酸藥物遞送系統研究領域的熱點之一。介紹核酸藥物遞送載體多肽修飾的兩種主要方式-共價綴合和非共價絡合，重點綜述近年來多肽綴合物和復合物以及多肽修飾的載體在核酸藥物遞送系統中的應用研究，探討多肽介導的核酸藥物遞送系

2、統在應用中存在的問題，為新型核酸藥物遞送系統研發提供參考。關鍵詞 多肽載體;核酸藥物;藥物遞送系統核酸藥物(nucleic acid drug)是目前國際上重點關注的一類新型生物技術藥物，具有設計方便、特異性強、不易產生耐藥、利于快速反應等特點，可用于治療病毒感染性疾病、心血管系統疾病、代謝類疾病以及腫瘤等多種疾病1。自1998年第1個核酸類藥物VitraveneTM被美國FDA批準上市后，多個核酸藥物相繼進入臨床試驗2-3。然而，核酸藥物存在生物學穩定性差、易被體內核酸酶降解、生物利用度低、靶組織內聚集濃度低等缺點，其臨床應用進展緩慢。近年來，天然核酸藥物的化學修飾(如硫代修飾、混合骨架核酸

3、等)、新型核酸類似物(如肽核酸)等可提高核酸藥物穩定性的新技術以及核酸藥物靶向遞送技術的快速發展，極大地推動了核酸藥物的研發進展。2013年1月29日，在時隔15年之后，第3個也是首個全身給藥的核酸藥物KynamroTM被美國FDA批準上市，掀起了新一輪核酸藥物研究熱潮。利用載體技術和給藥體系提高核酸藥物生物學活性，改善其體內分布，增強其對細胞的靶向性以及被細胞攝取能力，提高靶組織中藥物的濃度和生物利用度，是核酸藥物研發的重點和趨勢所在。目前最為常見的核酸藥物遞送載體主要有以下幾類:脂質體(如普通陽離子脂質雙層、脂質體DOTAP、Lipofectine、pH敏感脂質體等)、陽離子多聚復合物如聚

4、乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)等、樹枝狀高聚物(DEN)和各類多聚物的微粒體(如聚氰基丙烯酸酯納米粒、聚乳酸納米粒等)、基于特異性受體的配體介導的核酸分子靶向遞送系統和多肽蛋白類遞送載體以及利用唾液酸蛋白、多糖、表皮生長因子、葉酸、轉鐵蛋白、甾體激素、單克隆抗體等靶向分子修飾而具有主動靶向作用的納米粒4-5。隨著新載體技術和給藥體系的不斷發展，一些核酸藥物研發公司相繼構建了各具特色的遞送技術平臺，其中具有代表性的核酸藥物遞送系統包括Arrowhead Research公司的動態多價偶聯遞送系統(dynamic polyconjugates，DPC)6和轉鐵蛋白靶向的環糊精納米粒遞

5、送系統(RONDELTM)7、8、Silence公司基于脂質的siRNA遞送系統(AtuPLEXTM)Tekmira公司的脂質納米粒(LNP)技術9以及Alnylam Pharmaceuticals公司的GalNAc-siRNA(N-乙酰半乳糖胺與siRNA的結合體)肝靶向遞送系統10等。基于上述遞送系統，已有多個核酸藥物相繼進入臨床研究階段(見表1)，并有多個相關藥物處于申報臨床研究或臨床前研究的不同階段。表1 基于新型遞送系統的臨床在研核酸藥物Table 1 Nucleic acid drugs based on the new delivery system in clinical de

6、velopment開發公司Alnylam PharmaceuticalsSilence Therapeutics Arrowhead Research藥物ALN-TTRscAtu027ARC-520CALAA-01載體GalNAc-siRNAAtuPLEX?DPCRONDEL ?靶標甲狀腺素運載蛋白(TTR)蛋白激酶N3(PKN3)乙型肝炎病毒(HBV)核苷酸還原酶亞單位 M2(RRM2)埃博拉病毒L聚合酶、病毒蛋白24(VP24)和病毒蛋白35(VP35)適應證TTR介導的淀粉樣變性 (ATTR)胰腺癌慢性乙型肝炎感染淋巴瘤開發階段臨床期臨床b/a期臨床期臨床b期TekmiraTKM-Ebo

7、laLNP埃博拉病毒感染臨床期在眾多靶向遞送技術當中，多肽蛋白類遞送載體是目前研究的熱點之一。其中較為簡單的一種遞送系統是以陽離子肽即細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPP)或蛋白轉導域(protein transduction domains，PTD)為遞送載體，而CPP不僅可用來提高核酸藥物的細胞攝取率，還能靶向特定細胞表面受體或組織。自1994年第1條CPP被Fawell等發現以來，一系列新的CPP相繼被報道。目前，盡管多肽介導的核酸藥物轉運機制尚未完全闡明，但該遞送載體發展迅速，已經成為核酸藥物研發的重點領域11-12。合成法完成，通常反應效率較高。連接

8、多肽與寡核苷酸分子的連接臂需要具有一定的化學穩定性，從而使肽-寡核苷酸綴合物在進入體內和隨后的轉運過程中保持穩定，而在靶細胞中連接臂可被特定蛋白水解酶降解，從而釋放核酸藥物。例如，二硫鍵已被證明可用于多肽介導的核酸藥物遞送系統14。研究發現，二硫鍵在綴合物到達內涵體或細胞質后才會斷裂，這種斷裂使多肽不會在細胞內影響寡核苷酸分子對其靶標的抑制作用。但最近的體內實驗結果表明，這種斷裂不是必須的。二硫鍵以及巰基可能會增加核酸藥物的胞內攝取率，其作用機制尚不清楚15-16。共價綴合的優點在于可以得到結構明確、單一的化合物，簡化了藥物研發過程。但這種修飾方法也存在一定的局限性，如強陽離子多肽與帶負電荷的

9、寡核苷酸綴合和純化存在一定的難度，限制了用于綴合的多肽類型;此外，共價鍵修飾可能會影響帶電荷核酸分子的生物活性。因此，這種策略更適用于中性的磷酸二酰胺嗎啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO)(Summerton等, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 1997年)和肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)的修飾(Nielsen, Methods Enzymol, 1996年)。1 核酸藥物遞送載體的多肽修飾策略核酸藥物遞送載體的多肽修飾主要采用共價綴合和非共價絡合兩種方式。1.1

10、共價綴合共價綴合是通過二硫鍵、硫醚鍵、硫醇馬來酰亞胺、磷酸二酯鍵等共價鍵而將多肽共價綴合到寡核苷酸分子或其他載體上13，這種綴合可經固相合成法或液相非共價絡合是通過非共價鍵將多肽及其衍生物與帶負電荷的寡核苷酸分子絡合，形成復合物。一些肽載體含有疏水性基團(如疏水性氨基酸及脂肪酸、膽固醇等)，這些疏水性基團可與中性及帶負電荷的分子絡合形成復合物，這種絡合形成的復合物能夠更好地攜帶寡核苷酸分子透過質膜，將其高效地遞送至靶部位17。非共價鍵連接時，不需要對寡核苷酸進行末端修飾，僅通過簡單的混合即可形成復合物，同時這種方法還能有效防止核酸酶對寡核苷酸的降解，因此該方法應用更為廣泛。近年來，隨著遞送技術

11、的不斷發展，還有多種修飾策略相繼被提出。如Futaki等采用新一代非共價結合化學修飾多肽載體技術，將十八烷酰基化的陽離子多聚精氨酸肽用作質粒DNA的轉運載體獲得成功18。而且，一些肽相關納米載體、陽離子聚合物以及多肽復合體/脂質體等也被用于寡核苷酸遞送研究。團隊將可特異性結合整合素v3受體的環肽cRGD與靶向血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)的siRNA分子進行共價綴合后發現，cRGD-VEGFR2 siRNA可特異性進入整合素v3受體陽性的新生血管內皮細胞-人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)，并抑制VEGFR2表達;cRGD-VEGFR2 siRNA顯微注射入斑馬魚體內后，能夠抑制斑馬魚

12、新生血管的形成;在小鼠體內實驗中，cRGD-VEGFR2 siRNA不會誘導先天的免疫反應，且可特異性靶向腫瘤組織，具有顯著的抗腫瘤作用21。1.2 非共價絡合CPP與PMO的綴合物PPMO近年來被廣泛應用于抗病毒、抗細菌以及治療遺傳性疾病等領域。PMO最早由AVI生物制藥公司(現更名為Sarepta Therapeutics公司)開發22，具有諸多優點，如不被酶降解、在細胞內穩定性強、對細胞無毒副作用、且不會激活細胞分泌干擾素及免疫應答等。但是，由于PMO的分子結構中不帶有任何電荷，使其無法被細胞表面受體識別，也無法通過轉染方式導入細胞內，極大地阻礙了其實際應用。而PPMO技術的發展則有力地

13、推進了PMO的應用研究，研究人員利用該遞送技術確證了PMO在多種病毒感染性疾病中均具有較好的抗病毒作用，如卡波濟肉瘤相關皰疹病毒、單純皰疹病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、登革熱病毒、柯薩奇病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、西尼羅河病毒以及冠狀病毒等23。另外，有研究表明，相應的多肽-PMO綴合物可干擾血凝素激活蛋白酶TMPRSS2 pre-mRNA的剪接，有效降低甲型流感病毒的滴度24。在人呼吸道合胞病毒感染的細胞和小鼠模型中，相應的多肽-PMO綴合物均可有效阻斷病毒復制;且在感染早期給藥，可顯著降低小鼠肺組織的病毒滴度25。另有研究表明，對于感染豬生殖和呼吸綜合征病毒的豬，無論是感染前還是感染后給

14、予相應的多肽-PMO綴合物治療均可有效降低病毒血癥和間質性肺炎的發生26。在抗細菌感染方面，Sarepta公司與其合作者近期研究發現，靶向金葡菌促旋酶A mRNA的PPMO在動物體內顯示出良好的抗菌作用，其可特異性結合靶基因，抑制細菌蛋白質表達，還可避免傳統抗生素的耐藥問題。目前，該公司的這一抗菌新藥正處于臨床前研發階段。2 多肽綴合物和復合物在核酸藥物遞送系統中的應用20世紀90年代Bongartz等(Nucleic Acids Res, 1994年)首次報道了多肽介導的反義核酸在細胞內的遞送過程，即將CPP通過與反義核酸共價連接形成綴合物，介導核酸進入細胞。這一方法隨后被廣泛用于PNA、P

15、MO、不同修飾的反義核酸以及siRNA等核酸藥物的修飾。Pooga及其研究團隊在體內外實驗中發現，CPP與靶向甘丙肽受體型mRNA的PNA共價綴合后，可有效地提高PNA在人黑色素瘤細胞中的攝取率;多肽共價修飾可提高PNA對體內甘丙肽受體的抑制作用(Pooga等, Nat Biotechnol, 1998年)。另有研究人員將F-3肽與經不同化學修飾的反義核酸共價綴合后發現，這種共價綴合可顯著提高核酸藥物在體內對轉錄因子ld1的抑制作用19。Meng等20經實驗研究發現，將Tat(47-57)肽與siRNA綴合后，可有效介導siRNA進入細胞。南方醫科大學的季愛民教授及其研究段。PPMO抗菌劑的開

16、發將為細菌感染性疾病提供新的治療策略27。另外，Sarepta公司一直致力于遺傳性疾病-杜氏肌肉萎縮癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)治療藥物的開發，PPMO技術也被證實可提高PMO對DMD的治療效果28-29。盡管PMO的安全性已經得到證實，但是PPMO技術引入綴合肽鏈后，其安全性有待進一步評價。清蛋白非特異性結合以及毒性等問題，只能用于寡核苷酸分子的體外轉染，并不適用于體內遞送，如lipofectin或lipofectamine等。采用親水聚合物(如PEG等)對脂質體表面進行功能化修飾，則能將其改造為核酸分子的體內遞送載體38。但PEG修飾后的脂質體載體

17、與細胞膜的相互作用減弱，降低了核酸分子的細胞攝取率，且修飾后的載體還不利于核酸分子的胞內釋放39。為了提高脂質體載體的核酸遞送效率，研究人員在新的脂質體載體中引入了多肽分子。當富含精氨酸的CPP結合到脂質體載體表面后，可顯著提高載體的遞送效率38，且安全性可控40。另一組研究人員將陽離子脂質體用含16個賴氨酸殘基和靶向肽Y的嵌合肽進行修飾后，成功用于遞送靶向熒光素酶等目標基因的siRNA41。多功能信封式納米裝置(multifunctional envelope-type nanodevices, MEND)是由Harashima和Futaki團隊研發的一種基于脂質體的核酸分子胞內遞送載體系統

18、42。該系統將寡核苷酸與多聚陽離子魚精蛋白聚合后用一種含陰陽離子和輔助脂質如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的脂質信封包裹，其中輔助脂質DOPE的作用是增加核酸分子的胞內釋放。除了表面修飾PEG外，該系統還可利用十八烷基化肽自發插入脂質膜的特點將多肽結合到脂質體表面。為了增加核酸分子遞送過程中的靶向性以及胞內釋放，此研究團隊在新型MEND系統中引入了可斷裂的PEG連接鍵以及靶向特定受體的多肽或融合肽，并利用此載體將未修飾的反義寡核苷酸和siRNA遞送入細胞內43。MEND系統已被報道成功用于siRNA對腫瘤組織的靶向遞送44。由于多數遞送載體都會引發機體免疫反應或全身性毒性，因此有研究人員提出另

19、一種生物衍生遞送載體-外泌體。外泌體是由大多數細胞和體液分泌而自然產生的膜囊泡，能攜帶多種蛋白質、mRNA和miRNA，參與細胞通訊和遷移、血管新生、腫瘤發生發展等生理過程。這種外泌體是從內體-溶酶體途徑衍生而來，直徑40120 nm，在轉運RNA至靶細胞的過程中發揮著重要作用45，同時它還具備將miRNA轉運至靶細胞并誘導基因沉默的能力46。因此，外泌體適核酸遞送載體修飾策略的另一方向是利用合成或天然的陽離子多聚復合物作為核酸分子的遞送載體，這些線性或分枝狀的多聚復合物主要包括聚-L-賴氨酸(PLL)、PEI等。這些多聚復合物可將寡核苷酸聚集成小顆粒(DNA復合物)，通過內吞作用使核酸分子進

20、入細胞。但是，PEI等陽離子聚合物的非生物降解特性使得其潛在的安全性問題備受關注30;另外，PEI會與血清中的一些蛋白相互作用，導致其體內遞送效率降低31。研究人員嘗試用聚乙二醇(PEG)修飾PEI聚合物以提高其在血清中的穩定性，但實驗顯示，這種修飾方法并沒有顯著增加核酸的細胞攝取率以及胞內釋放32。而進一步利用多肽修飾這類陽離子聚合物，則能提高核酸分子的組織靶向性、細胞透膜率以及生物活性。研究人員發現，將Tat肽與PEG化PEI形成的共聚物和2-Ome修飾寡核苷酸混合并給予mdx小鼠后，能改善抗肌肉萎縮蛋白pre-mRNA的外顯子跨讀(exon-skipping)33。Schiffelers

21、等34將整合素結合肽RGD修飾的PEG化PEI用于靶向VEGFR-siRNA的轉運，獲得成功。而將轉鐵蛋白多肽修飾PEG化PEI后，也能將siRNA高效特異性地轉運至神經細胞瘤移植模型的腫瘤細胞中35。此外，借助葉酸與其受體的特異性相互作用，葉酸-PEG-siRNA與固定結構聚陽離子復合物可沉默目標基因36。浙江大學的梁文權研究團隊近期還報道了一種CPP修飾的甘露糖基化PEI衍生物(Man-PEI1800-CPP)，并將其成功用于DNA分子的體內遞送37。多肽分子與LNP結合而形成的復合物是核酸藥物的另一遞送載體。目前常用的陽離子脂質體存在著與血合作為核酸分子遞送載體。Alvarez-Ervi

22、ti等47利用外泌體成功將外源性siRNA轉運至小鼠大腦，其間，選用的外泌體來源于未成熟的樹突狀細胞，并將表達腦靶向肽RVG的質粒轉染至樹突狀細胞，使RVG與外泌體表面結合，以增強外泌體的腦靶向性;隨后借助電穿孔技術導入靶向目的基因的siRNA，再將此RVG-外泌體系統給小鼠靜注，致使所載siRNA靶向遞送至小鼠大腦，特異性敲除小鼠大腦皮質和紋狀體組織中的目的基因。為進一步驗證這種RVG-外泌體系統的遞送能力，在小鼠實驗中，該系統還被用于遞送靶向-分泌酶的siRNA，結果，在小鼠大腦皮質中可觀察到靶基因顯著被抑制，胞外淀粉樣蛋白1-42(A1-42)的蓄積減少，而值得注意的是，RVG-外泌體遞

23、送系統重復給藥后，并沒有觀察到明顯的毒性或免疫原性反應。類載體遞送效率的報道較少，Fucharoen研究小組在對PPMO綴合物的研究過程中發現該載體系統靜脈注射的遞送效率優于皮下注射50。雖然肽類載體對核酸藥物的遞送作用已被多項研究證實，但對其所致毒性和免疫刺激性缺乏系統性研究。已有研究顯示，Penetratin-siRNA綴合物氣管內給藥可誘發先天免疫反應52，而其腹腔內給藥則不會引起免疫反應，在小鼠模型實驗中，其100 mg?kg-1腹腔內給藥表現出良好的耐受性53。盡管CPP具有潛在的免疫刺激性，但其與PMO的綴合物在動物體內并未觀察到有明顯的免疫刺激性54，且肽-PNA復合物也未見報道

24、會誘導免疫反應。由于PMO不帶有任何電荷，毒副作用低，在動物體內及臨床試驗中具有良好的安全性55，因此引入的多肽序列和臨床使用劑量對于PPMO綴合物的安全性評價至關重要。Amantana等56在大鼠體內合理評價了可抑制c-myc表達的PPMO綴合物的安全性，結果顯示，低劑量(15 mg?kg-1)時，PPMO具有良好的耐受性;但在高劑量(150 mg?kg-1)組中，大鼠出現了如嗜睡、體質量下降、血尿素氮和血清肌酐升高等現象;致死劑量為400 mg?kg-1。AVI生物制藥公司發表的PPMO綴合物在非人靈長類動物模型中的安全性評價報告顯示，健康獼猴以9 mg?kg-1劑量靜注PPMO(每周1次

25、，共4次)后，出現劑量依賴的腎臟腎小管變性;而mdx小鼠接受更高劑量PPMO給藥后，并沒有觀察到明顯的毒副作用57。提示，PPMO在不同物種中毒性閾值存在顯著差異。類似地，一種綴合了含有賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸殘基兩親肽的PNA也表現出嚴重的腎毒性，健康小鼠接受其40 mg?kg-1劑量全身給藥后，出現深度近端腎小管壞死，而在相同劑量條件下，PNA與含有精氨酸或精氨酸殘基的兩親肽的綴合物卻沒有顯現相同毒性58。4 多肽介導的核酸藥物遞送系統在應用中存在的問題大量研究表明，多肽載體在體內外均具有良好的遞送效果，但其脫靶效應、體內分布、不同給藥途徑對分布的影響以及毒副作用還有待進一步考察。肽類載體的

26、體內分布數據可以通過評價其誘導的生物學效應、檢測直接標記的遞送載體、使用轉基因動物及報告基因系統等方法來獲取，但這些方法各自都有一定的局限性。比如，肽類載體誘導的生物學效應檢測只能局限在表達靶基因的組織中開展，不表達靶基因的組織中檢測不到相應生物學效應的改變;熒光分子或放射性同位素雖然已成功應用于標記和示蹤肽類載體48，但載體-核酸分子存在血清穩定性等問題，只對肽類載體進行標記并不能真實反映核酸分子的分布情況49;EGFP-654轉基因小鼠模型可被用來檢測PPMO的體內分布，但是該模型無法反應PPMO對疾病病理過程的影響50。為了優化藥物分布模式，獲得合理的安全曲線，需要對肽類載體的給藥途徑(

27、靜脈、腹腔、皮下、口服或鼻腔等)作進一步考察51。給藥方式的選擇不僅要考慮多肽的性質和疾病模型的靶向需求，還應充分考慮肽類載體的毒理學特征。目前直接比較不同給藥途徑間肽5 結語與展望多肽介導的核酸藥物遞送系統能顯著提高藥物的透膜性和靶向性，減少其毒副作用，增強療效，在藥物靶向遞送系統中具有廣闊的應用前景。公司基于PPMO遞送技術而開發的用于治療結核桿菌感染的PMO藥物正處臨床前研發階段。加拿大BiOasis生物技術公司最新研發的多肽載體Transcendpep經實驗證實能有效遞送siRNA跨越血腦屏障進入腦細胞，特異性抑制靶基因，該項目已進入臨床研究申報階段。可以預見，在不久的將來，會有更多基

28、于多肽遞送載體的核酸新藥品種有望進入臨床研究。不過，肽類載體的制備工藝、脫靶效應及毒副作用是其在核酸藥物遞送系統應用研究領域中亟需解決的問題。參考文獻1Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modicationsJ. Eur J Biochem, 2003, 270(8): 1628-1644.2Rayburn E R, Zhang R. Antisense, RNAi, and gene silencing strategies for therapy: mission possible o

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