1、1、生物技術(shù)制藥具有什么特征？(1)高技術(shù) 生物技術(shù)制藥的高技術(shù)性主要表現(xiàn)在其高知識層次的人才和高新的技術(shù)手段。 生物制造是一個知識密集、技術(shù)含量高、多學科高度綜合互相滲透的新興產(chǎn)業(yè)。(2)高投入 生物制藥是一個投入相當大的產(chǎn)業(yè)。(3)長周期 生物藥物從開始研制到最終轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物要經(jīng)過很多環(huán)節(jié)：實驗室研究階段，中試生產(chǎn)階段，臨床試驗階段規(guī)模化生產(chǎn)階段市場商品化階段，藥政審批程序。(4)高風險生物醫(yī)藥是耗資巨大的系統(tǒng)工程，任何一個環(huán)節(jié)失敗都將導致前功盡棄。(5)高收益 生物技術(shù)可以大量廉價的不易生產(chǎn)的藥物，以滿足患者治療的需要，具有巨 大的社會經(jīng)濟效益。2、基因工程制藥中，質(zhì)粒不穩(wěn)定性如何產(chǎn)生的，

2、如何提高質(zhì)粒穩(wěn)定性？質(zhì)粒不穩(wěn)定分分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象，影響因素：一是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率，質(zhì)粒丟失率與宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)；二是這兩種菌比生長速率差異的大小。質(zhì)粒的結(jié) 構(gòu)不穩(wěn)定性是dna從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變，質(zhì)粒的自發(fā)缺 失與質(zhì)粒中短的正向重復序列之間的同源重組有關(guān)，在無源性的兩個位點之間也會發(fā)生缺 失，培養(yǎng)基條件會對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。方法:選擇合適的宿主菌、選擇合適的載體、選擇壓力、分階段控制培養(yǎng)、控制培養(yǎng)條件固定化3、能談談基因工程制藥過程中，如何獲得目的基因么，至

3、少介紹3種方法？方法：反轉(zhuǎn)錄法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法、化學合成法。反轉(zhuǎn)錄法：為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的dna序列，可以從生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的真核細胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白mRNA互補dna,再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶或 DNA聚合酶I作用下，最終合成編碼該多肽的雙 鏈DNA序列。反轉(zhuǎn)錄法：mRNA的純化cDNA第一條連的合成cDNA第二條鏈的合成cDNA克隆 將重組體導入宿主細胞 cDNA文庫的鑒定7目的cDNA克隆的分離和鑒定。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法：mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，不需要再合成 DNA的第 二條鏈，而是在特異引物

4、協(xié)助下，用PCR法進行擴增，特異的合成目的 cDNA鏈，用于重組、克隆。化學合成法的缺點：較小分子蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以人工化學合成。化學合成法有個先決條件是必須已知其蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再按相應的密碼子推導出DNA的核甘酸序列。4、用于基因工程制藥表達的宿主細胞即受體，有哪些？各有什么優(yōu)缺點？基因表達的微生物宿主細胞：原核生物，常用的有大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、鏈霉菌。真核生物，常用的有酵母菌、絲狀真菌。(1)大腸桿菌：優(yōu)點：細胞內(nèi)不溶性表達、胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達，極少數(shù)情況下也可分泌到細胞外。缺點：提取困難、真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體、對蛋白產(chǎn)物 不能糖基化、大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)

5、霉素很難除去，還會產(chǎn)生蛋白酶破壞目的蛋白質(zhì)。(2)枯草芽抱桿菌：優(yōu)點：分泌能力強，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到細胞外，不形成包 含體。缺點：不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，有很強的胞外蛋白酶，對產(chǎn)物進行不同程度降解。(3)鏈霉菌：優(yōu)點：非致病適用安全，分泌能力強，可將表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中, 具有糖基化能力；變鉛青鏈霉菌限制修飾能力弱，可作為理想的受菌體；已構(gòu)建一系列有 效的載體；下游培養(yǎng)工藝成熟。(4)酵母：基因組小，世代時間短，有單倍體、雙倍體兩種形式。繁殖速度快廉價，沒有 毒性。(5)絲狀真菌：有很強的蛋白分泌能力；能正確的進行翻譯后加工，糖基化，有成熟的發(fā) 酵和后處理工藝。5、生物技術(shù)制藥為

6、何要中試？對于基因工程技術(shù)制藥來說，中試需要考慮哪些因素？ 中試可以得到大量產(chǎn)品供臨床試驗，也可以將中試所得數(shù)據(jù)供生產(chǎn)設計時參考。考慮問題：適宜商品化生產(chǎn)的工程菌，設計發(fā)酵反應器，選擇反應過程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分， 維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝檢測方法，工藝控制方法，工藝自動化使用方法，生物 催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇。6、基因工程制藥過程中，如何實現(xiàn)高密度發(fā)酵？以原核表達為例。【這個本來想在發(fā)酵工程制藥講，但看來是講不到了，但希望你能自己學習，基本要點在書43-44頁，你可以從41頁看起】發(fā)酵條件的改進：培養(yǎng)基的選擇 ：要盡量選擇容易被工程菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)，普遍采用6g

7、/L的甘油作為高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，高密度發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的濃度也要比普通 培養(yǎng)基高23倍，才能滿足高密度發(fā)酵中工程菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。建立流加式培養(yǎng)方式： 一般、采用指數(shù)流加的方法。提高供養(yǎng)能力：小型發(fā)酵罐采用空氣和純氧混合通氣的方法 也可以采用增加發(fā)酵罐的壓力的方法，向發(fā)酵液中添加過氧化氫，在細胞過氧化氫酶的作 用下，細菌可放出氧氣供自身使用。構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌：阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑、對碳代謝流進行分流、 限制進入糖酵解途徑的碳代謝流、引入血紅蛋白基因。構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：培養(yǎng)大腸桿菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株7、基因工程藥品的質(zhì)量控制有哪些？(1)生物

8、材料的質(zhì)量控制，主要包括對目的基因，表達載體及宿主細胞的檢查。目的基因 需明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過；應提供載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及 各個組成部分的來源與功能；宿主細胞應提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及生物學特性；需闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)，證明宿 主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核甘酸序 列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動子與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平。培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌的貯存中要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程 菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復生產(chǎn)的過程中，工程菌表達穩(wěn)定，

9、始終能排除外 源微生物污染。生產(chǎn)用細胞庫 基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)采用種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無 細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并用原始種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫；建原始種子 批需證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存和預計使用期，保存與復蘇 時種子的穩(wěn)定性；對生產(chǎn)的種子，應詳細敘述細胞的生長于產(chǎn)品生成的方法和材料，并控 制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細胞、載體系統(tǒng)穩(wěn)定性確 定最高允許傳種代數(shù)。培養(yǎng)過程，培養(yǎng)過程要測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞 長期培養(yǎng)后的基因型特征依宿主細胞、載體穩(wěn)定系與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并 定期評價細胞

10、系統(tǒng)和產(chǎn)品。培養(yǎng)周期結(jié)束時，應檢測宿主細胞、載體系統(tǒng)的特性。純化過程的質(zhì)量控制產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)，確證提純分子批間保持一致 性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制 基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求：產(chǎn)品的鑒定、純度、 活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性生物活性的鑒定理化性質(zhì)的鑒定：非特異性鑒定、特 異性鑒定、相對分子質(zhì)量鑒定、等電點測定、肽圖分析、氨基酸組成分析、部分氨基酸序 列分析、蛋白質(zhì)二硫鍵分析蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)純度分析雜志檢測穩(wěn)定性考察 產(chǎn)品一致性保證。8、如果說某個基因是非常有前景的腫瘤治療靶標，抑制這個基因表達可以治療某種癌癥。最

11、簡單的做法你可以直接敲除該基因就行了【如果能做到的話，a_ao另一種方式就是制備這個蛋白的抗體，中和抗體類型的，可以直接與體內(nèi)這個蛋白結(jié)合而抵消該蛋白的功能。如果讓你從基因工程制藥入手，結(jié)合抗體工程技術(shù)，從技術(shù)角度上給個開發(fā)這個藥物的戰(zhàn) 略規(guī)劃，你能在30分鐘內(nèi)解答出來么？要合理合據(jù)啊。從雜交瘤細胞中提取總 RNK RT-PCR獲得重鏈可變區(qū)基因片段/RNA- RT-PCR獲得輕鏈可變 區(qū)基因片段-構(gòu)建重鏈基因的表達載體/構(gòu)建輕鏈基因的表達載體-篩選陽性克隆-轉(zhuǎn)染細菌-挑選雙重轉(zhuǎn)染子-制成原生質(zhì)體-輕染哺乳類細胞-嵌合抗體的表達如何制備單克隆抗體及注意事項？傳統(tǒng)的細胞融合技術(shù)啥情況？如果改用基

12、因工程技術(shù)，如何處理？淋巴細胞與骨髓瘤細胞用融合劑PEG處理，使兩細胞融合，把融合細胞選擇出來使成為單個細胞，培養(yǎng)雜交瘤細胞，使能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞克隆化，把以克隆化的雜交瘤細胞進行大量培養(yǎng)和注入小鼠體內(nèi)，小鼠腹水中含有單克隆抗體。注意事項：用于免疫的動物應選擇與親本骨髓瘤細胞同一品系的動物、抗原免疫用的抗原盡量設法提高其純度并保證其活性、融合劑對細胞有毒性，一般采用分析純規(guī)格。濃度越 高對細胞毒性越大、防止操作污染。傳統(tǒng)的細胞融合技術(shù)：取適量的脾細胞和骨髓瘤細胞進行混合，在聚乙二醇作用下誘導他們?nèi)诤希瑫r間控制在 2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將 PEG融合液緩慢稀釋10、我們說單克隆抗體那是前

13、（錢）景杠杠滴誘人啊，但我們又談到單抗要改造，你能談談為啥要改造么？你能簡單介紹幾種改造的抗體形式么？降低鼠源性單克隆抗體分子的免疫原性，降低抗體的相對分子質(zhì)量，以增加組織的通透性。人鼠嵌合抗體：人IgG小鼠IgV;改形抗體人鼠 CDR替換人CDRDFab完整的L鏈和FdFvVH和VLD單鏈抗體VH-多肽-VL©單域抗體VH或VL最小識別單位一個 CDR11、能談談什么是固定化酶么？固定化酶有哪些優(yōu)點？是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復和連續(xù)使用的酶。優(yōu)點：固定化酶可重復使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。固定化酶極易與反應體系分離，簡化了提純工藝，而且產(chǎn)品收率高、質(zhì)量好

14、。在多數(shù)情況下，酶經(jīng)固定化后穩(wěn)定性得到提高。固定化酶的催化反應過程更易控制。固定化酶具有一定的機械強度，可以用攪拌或裝柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反應的連續(xù)化和自動化操作。固定化酶與游離酶相比更適于多酶體系的使用，不僅可利用多酶體系中的協(xié)同效應使酶催化反應速率大大提高，而且還可以控制反應按一定順序進行。談談你對酶工程制藥的認識？酶工程制藥：可初步定義為利用酶的催化性質(zhì)、動力學性質(zhì)、可固定化性質(zhì)生產(chǎn)一種藥物或藥物中間體的技術(shù)體系。它是酶學理論與制藥技術(shù)相結(jié)合而形成的一種新技術(shù)根據(jù)其在制藥過程中的用途可分為：有治療作用的藥用酶和起催化作用的酶，以及起預處 理作用的酶。酶工程制藥的優(yōu)點不需要有

15、毒原料；反應條件溫和；增加原料中原子的利用率；廢物排放少；可以制造出化學方法不能制造的藥物。應用在多個方面：氨基酸生產(chǎn)、丙氨酸生產(chǎn)、抗生素的生產(chǎn)13、簡單談談動物細胞工程制藥的優(yōu)缺點？ 缺點：培養(yǎng)條件高、成本高，產(chǎn)量低優(yōu)點：操作簡單、無化學毒性、對細胞的損傷小、分泌胞外、收集純化比較方便，較完善 的翻譯后修飾，與天然產(chǎn)品一致。14、生產(chǎn)用動物細胞的要求有哪些？從正常組織液中分離的原代細胞、二倍體細胞系可無限傳代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細胞系、用這些細 胞進行融合和重組的工程細胞系我們說單位產(chǎn)量可以影響公司運營成本，以基因工程制藥為例，談談如何實現(xiàn)外源基因在 宿主細胞即受體中的高表達？有效的轉(zhuǎn)錄起始與基因的高

16、效表達，選擇強的可調(diào)控的啟動子及相關(guān)的調(diào)控序列，是組 建一個高效表達載體首先要考慮的問題。最理想的強的可調(diào)控的啟動子應該是：在發(fā)酵的 早期階段表達載體的啟動子被緊緊地阻遏，這樣可以避免出現(xiàn)表達載體不穩(wěn)定，細胞生長 緩慢或由于產(chǎn)物表達而引起的細胞死亡等問題。對于原核細胞而言，可分為可誘導型啟動 子，比如lac,trp,入Pr,tac,phoA等，和組成型啟動子，如 T7噬菌體啟動子。而對于真核細 胞的表達載體而言，啟動子和增強子作為兩個重要的轉(zhuǎn)錄控制序列，是外源基因在真核細 胞中高效表達所必需的。mRNA的有效延伸和轉(zhuǎn)錄終止與基因的高效表達。轉(zhuǎn)錄開始后，mRNA開始進行有效延伸，終止以及穩(wěn)定的積

17、累，在這個過程中，轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止能誘發(fā)轉(zhuǎn)錄中 的mRNA分子提前終止。由于衰減子序列是負調(diào)節(jié)元件，為保證mRNA轉(zhuǎn)錄安全，在表達載體的組建中要盡量避免其存在。為了防止mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中的非特性終止，抗終止序列元件可加入到表達載體上。有效的翻譯起始與基因的高效表達，在原核細胞中影響翻 譯起始的因素有：起始密碼子、核糖體結(jié)合部位（SD起始密碼子與 SD的距離和核甘酸組成、mRNA的二級結(jié)構(gòu)以及其上游 5 '非翻譯區(qū)序列和蛋白質(zhì)編碼區(qū)的5 '端序列等。作為翻譯起始，可達到最大效率的一般原則是：1）AUG（ATG是最首選的起始密碼子。GUG,UUG, AUU和AUA有時也用作起始密碼子，但非最佳選擇2）SD序列中至少含有AGGAGG序列中的四個堿基3） SD與起始密碼之間的距離以 9±3為適宜4）如果在起始密 碼子AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻譯效率提高 5）在翻譯起始區(qū)周圍的序列應不形成明顯的二級結(jié)構(gòu)，使翻譯起始調(diào)控元件易被核糖體識別和結(jié)合6）通過突變mRNA5'非翻譯區(qū)的核甘酸序列，去減少、去除某些stem-loop結(jié)構(gòu)可以提高翻譯的起始效率。mRNA的二級結(jié)構(gòu)與基因的高效表達無論真核還是原核基因的表達， 翻譯的起始常被 mRNA不適當?shù)亩壗Y(jié)構(gòu)所影響。二級結(jié)構(gòu)比較松