1、生物大實驗三微生物學部分實驗目錄實驗一、 培養基的配制和滅菌實驗二、 微生物的分離、接種及培養法實驗三、 水中細菌總數和大腸菌群的檢測實驗四、 微生物的快速鑒定和自動化分析技術實驗五、 抗微生物藥物敏感性試驗實驗六、 微生物的生理生化反應實驗七、 微生物菌種保藏實驗八、 沉淀反應實驗九、 細菌鞭毛染色及其運動的觀察實驗十、 細菌芽孢、莢膜的染色及觀察實驗一、培養基的配制和滅菌一、實驗目的1.了解配制培養基的原理，并掌握配制培養基的一般方法和步驟。2.學習幾種常用培養基的配制、分裝和滅菌的操作方法。3.進一步熟練掌握手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。二、實驗器材1.藥品及試劑：可溶性淀粉，葡萄糖，

2、KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，K2HPO4，1mol/L NaOH，瓊脂，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，馬鈴薯2.儀器及其它試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(5.5-9.0)、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH試紙三、實驗內容1.分組配制高氏一號培養基300ml。配方：可溶性淀粉20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2

3、O 0.01g 瓊脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62.配制牛肉膏蛋白胨培養基配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 水1000ml PH 7.4-7.63.配制馬丁氏培養基配方：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂1520g，水1000mL，自然pH。配制方法配制20馬鈴薯浸汁 取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml。80浸泡1h，用紗布過濾，然后補足失水至所需體積。100Pa滅菌20min。即成20馬鈴薯浸汁，貯存備用。配制時，按每100ml馬鈴薯浸汁加入2g葡萄糖，加熱煮沸后加入2g瓊脂，繼續

4、加熱融化并補足失水。4.每組制備玻璃珠無菌水(45ml)三角瓶2個。5.每組制備無菌水試管(4.5ml/管)10支。6.每組包9cm培養皿24套，6套為一包。7.每組包1ml吸管5支，玻璃刮鏟4個。四、方法步驟（一）培養基的制備與分裝1.稱量 按培養基配方比例依次準確地稱取藥品。可溶性淀粉先用少量熱水溶化后再加入其他成份，補足所需水分，混勻后加入瓊脂。2.熔化 在沸水浴鍋中加熱熔化。3.調pH 用1mol/L NaOH調pH至7.4-7.6。4.過濾 趁熱用多層紗布過濾（本實驗勿需過濾）5.分裝 將溶化的固體培養基趁熱加至漏斗上，裝試管時，注意管口不要沾上培養基。液體分裝裝量不超過試管的1/4

5、，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。6.加棉塞 培養基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管應先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標簽，注明培養基名稱、日期、組別。（二）無菌水的制備7.用量筒量取45ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。8.用5ml吸管取4.5ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（三）器皿的準備9.培養皿的包裝 每6套一包，用舊報紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴）。10.吸管的包裝 首先

6、在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結。11.玻璃涂布棒的包裝方法同吸管的包裝。（四）培養基、無菌水、器皿的滅菌12.將培養基、無菌水放入高壓蒸汽滅菌鍋內，1.05kg/cm2壓力，121.3,20min濕熱滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。13.滅菌完畢，將試管培養基冷至50左右，將試管棉塞擱在玻棒（或木棍）上，擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。14.將滅菌的培養基放入37的溫室中培養2448h，以檢查滅菌是否徹底。15.器皿放入干熱滅菌箱內，加熱滅菌。五、思考題1.培養基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養菌是無菌的？2.加壓蒸汽滅

7、菌的原理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時就能達到所需滅菌溫度？為什么？3.干熱滅菌應該注意哪些事項？4.管口、瓶口為什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？為什么？六、實驗報告實驗二、微生物的分離、接種及培養法一、目的要求1.掌握倒平板的方法、劃線分離法、稀釋平板分離法和菌落（活菌）計數法。2.熟練掌握微生物的接種技術，學會微生物的一般培養方法和無菌操作技術。二、實驗原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離方法有：1)平板劃線分離法；2）稀釋平板分離法。在食品發酵工業中，通過微生物的分離、純化，選育優良的微生物菌種，以提高產品的

8、質量和產量；在食品衛生管理方面，需要進行微生物檢測，必須將微生物單一分離出來，加以鑒別和研究。土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。微生物的分離和接種是微生物學中重要的技術之一，需要嚴格的無菌操作。三、實驗材料1.菌種：葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌樣品。2.培養基：肉湯蛋白胨培養基（斜面、平板）、肉湯蛋白胨液體培養基、蔡氏瓊脂培養基（斜面、平板）。3.土壤（自帶）或其他物品；無菌水，無菌培養基，無菌吸管，無菌三角瓶等。 四、實驗內容與步驟（一）微生物的分離

9、技術1.平板劃線分離法 借助劃線使混雜的微生物在平板的表面分散開，以獲得單個菌落，從而達到 分離的目的。具體方法如下：倒制平板制備含菌樣品稀釋液劃線倒置適溫培養觀察記錄1)倒制平板：將固體培養基熔化冷卻至50-55注入培養皿內15ml（無菌操作）旋勻靜置凝固即成平板在皿蓋邊貼標。2)含菌樣液制備：樣品少許（1-10g），加入盛有無菌水的試管內，搖勻，制成菌懸液即可，能直接劃線的樣品（如體液、黏液、污水等），可省去這操作。3)劃線：左手持平板，接種環經灼燒滅菌后，以無菌操作取樣，迅速將接種環伸入培養皿，輕輕劃線（切勿把平板表面劃破）。然后將培養皿倒置放入恒溫培養箱37，培養24-48小時，觀察

10、平板上出現的現象，注意菌落的形狀，并做記錄2.稀釋平板分離法：采用稀釋手段，使樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿內，倒入培養基，搖勻靜置凝固后培養，這樣被分離的細菌被固定在原處而形成菌落，可作為一種計數方法。1)制備土壤稀釋液：（細菌的分離）以無菌操作，稱取樣品10g，加入裝有90ml無菌水的錐形瓶中，振蕩10-20分鐘，使土樣與水充分混合，即成 10-1土壤稀釋液，然后在酒精燈火焰旁，用無 菌移液管吸取1ml10-1的稀釋液注入9ml無菌水的試管內，制成10-2的稀釋液。用同樣方法再制成10-3，10-4，10-5，10-6的稀釋液。稀釋完畢后，可用原來的移液管，從菌液濃度最小的10

11、-6的稀釋液開始吸取1ml的10-6稀釋液，加到相應編號10-6的無菌培養皿內，以相同方法分別吸取1ml的10-5、10-4的稀釋液加到相應編號為10-5、10-4的無菌培養皿內。注意：每稀釋一個濃度，必須更換一支無菌吸管。用稀釋平板計數時，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時，稀釋度應高，反之則低。測定土壤細菌數量時，采用10-4、10-5、10-6稀釋度，測定放線菌數量時，采用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測定真菌數量時，采用10-2、10-3、10 -4稀釋度。2)平板的制作：將固體培養基融化，待冷卻至45-50左右，分別傾入已盛有10-4、10-5、10-

12、6稀釋液的無菌培養皿內，輕輕搖勻，靜置凝固。凝固后將平板倒置于37恒溫箱中，培養24-48小時，細菌即在所固定的位置長成肉眼能見的菌落。（二）微生物的接種方法將有菌的材料或純粹的菌種轉移到另一無菌的培養基上，這個過程就稱為接種。常用的接種方法如下：1.斜面接種：從已長好微生物的菌種管移接到另一斜面管的方法。左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平。用右手先將棉塞擰轉松動，再拿接種環，滅菌后，接種。此法用于好氣性微生物的接種。2.液體接種：由斜面菌接種到液體培養基（如試管或三角瓶等）中的方法。在將接種環送入液體培養基中時，使環在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然后塞上棉塞，再輕輕搖

13、動均勻，即可培養。如果菌種是培養在液體培養基中時，一般用移液管或滴管接種。3.穿刺接種：用接種針挑取菌種后，插入深層固體培養基內，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厭氣性細菌接種、檢查細菌的運動能力。4.平板接種：將菌種接至培養皿的方法，平板接種的目的是觀察菌落形態、分離純化菌種，活菌計數以及在平板上進行各種試驗時采用的一種接種方法，可分為下面幾種：1)斜面接平板a.劃線法：見平板劃線分離法。b.點種法：一般用于觀察霉菌和酵母細胞，輕輕點在平板的表面（根霉點一點，曲霉、酵母可點3-4點）即可。2)平板接斜面：一般是將經平板分散培養得到的單菌落接種到斜面，以便作鑒定或擴大培養、保 存之用。

14、注意事項不同種類的微生物，其培養溫度、培養時間有所不同。五、實驗報告1觀察劃線分離的菌落形態。2采用菌落計數法，計算出所檢土壤樣品的細菌總數（活菌數）。3稀釋分離時，為何要將融化的培養基冷卻到50左右，才倒入裝有菌液的培養皿內？實驗三、水中細菌總數和大腸菌群的檢測（一)實驗目的(1)了解和學習水中細菌總數和大腸菌群的測定原理和測定意義。(2)學習和掌握用稀釋平板計數法測定水中細菌總數的方法。(3)學習和掌握水中大腸菌群的檢測方法。（二）實驗原理水是微生物廣泛分布的天然環境。各種天然水中常含有一定數量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群

15、和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動物的傳染性排泄物。水的微生物學的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水標準規定，飲用水中大腸菌群數每升中不超過3個，細菌總數每ml不超過100個。所謂細菌總數是指1ml或1g檢樣中所含細菌菌落的總數，所用的方法是稀釋平板計數法，由于計算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)數，故其單位應是cfu/g(ml)。它反映的是檢樣中活菌的數量。所謂大腸菌群，是指在3724h內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱

16、，主要由腸桿菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數是指100ml水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細菌。這些細菌都可隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內數量最多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標。目前，國際上已公認大腸菌群的存在是糞便污染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢驗方法，常用多管發酵法和濾膜法。多管發酵法可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用于

17、自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質較多、易于阻塞濾孔的水樣。(三)實驗器材(1)菌落總數的測定：1)培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，無菌生理鹽水。2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。(2)大腸菌群的測定；1)培養基：乳糖膽鹽蛋白胨培養基：蛋白胨20g，豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25ml，水1000ml，pH7.4。制法：將蛋白胨、膽鹽從乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝，每瓶50ml或每管5ml，并倒置放入一個杜氏小管，l15滅菌15min。伊紅美藍瓊脂培養基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP04

18、2g，2伊紅水溶液20ml，0.65美藍水溶液l0ml，瓊脂17g，水1000ml，pH7.1。制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后分裝121滅菌15min備用。臨用時加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。乳糖發酵管：除不加膽鹽外其余同乳糖膽鹽蛋白胨培養基。2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。（四）實驗方法(1)水樣的采集：1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先

19、將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內檢測的，需放入冰箱中保存。(2)細菌總數的測定：1)水樣稀釋及培養：按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋。根據對水樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度(飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1ml稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度作3個重復。將熔化后保溫度45的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平皿，每皿約15ml

20、，并趁熱轉動平皿混合均勻。待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37培養箱內培養24±1h后取出，計算平皿內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得1mL水樣中所含的細菌菌落總數。2)計算方法：作平板計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數。3)計數的報告：平板菌落數的選擇：選取菌落數在30-300之間的平板作為菌落總數測定標準。一個稀釋度使用兩個重復時，應選取兩個平板的平均數。如果一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板計數作為該稀釋度的菌數。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計算半個平板

21、后乘2以代表整個平板的菌落數。稀釋度的選擇：a. 應選擇平均菌落數在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數報告之(表1例1)。b若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應報告其平均數；若比值大于2，則報告其中較小的數字(l例2、例3)。c若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(l例4)。d若所有稀釋度的平均菌落數均小于30、則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(1例5)。e. 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告之（表1例6)。f. 若所有稀釋度的平均菌落數均不在

22、30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數乘以該稀釋倍數報告之(表l例7)。細菌總數的報告：細菌的菌落數在l00以內時，按其實有數報告；大于100時，用二位有效數字，在二位有效數字后面的數字，以四舍五入方法修約。為了縮短數字后面的0的個數，可用10的指數來表示，如表1“報告方式”一欄所示。(3)大腸菌群的測定(多管發酵法)：表1 稀釋度的選擇及細菌數報告方式稀釋度及菌落數兩稀釋度之比菌落總數/（cfu/g或cfu/ml）報告方式（菌落總數）/（cfu/ml或cfu/g）10-110-210-31多不可計16420-1640016000或1.6×1042多不可計295461.

23、63775038000或3.8×1043多不可計271602.22710027000或2.7×1044多不可計多不可計313-313000310000或3.1×105527115-270270或6000-10107多不可計30512-3050031000或3.1×1041)生活飲用水或食品生產用水的檢驗：初步發酵試驗：在2個各裝有50ml的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白胨培養液(可稱為三倍乳糖膽鹽)的三角瓶中(內有倒置杜氏小管)，以無菌操作各加水樣100ml。在10支裝有5ml的三倍乳糖膽鹽的發酵試管中(內有倒置小管)，以無菌操作各加入水樣10ml。如果飲用水的大

24、腸菌群數變異不大，也可以接種3份100ml水樣。搖勻后，37培養24h。平板分離：經24h培養后，將產酸產氣及只產酸的發酵管(瓶)，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板(EMB培養基)上，37培養1824h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。復發酵試驗：將革蘭氏陰性無芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發酵管的平板上同類型菌落13個，37培養24h，如果產酸又產氣者，即證實有大腸菌群存在。報告：根據證實有大腸菌群存在的復發酵管的陽性管數，查表2

25、（或表3），報告每升水樣中的大腸菌群數(MPN)。2)水源水的檢驗：用于檢驗的水樣量，應根據預計水源水的污染程度選用下列各量。嚴重污染水：1，01，001000lml各1份。中度污染水：101，01，001ml各1份。輕度污染水：100，10，1，01mll各l份。大腸菌群變異不大的水源水：10ml各l0份。表2 大腸菌群檢索表（飲用水）012備注每升水樣中大腸菌群數03411接種水樣總量300ml（100 ml2份，10 ml10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表3 大腸菌群數

26、變異不大的飲用水陽性管數0123接種水樣總量300ml（3份100 ml）每升水樣中大腸菌群數341118表4 大腸菌群檢索表（嚴重污染水）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數備注10.10.010.001-900接種水樣總量為1.111（1，0.1，0.01，0.001ml各一份）-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+238000表5大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數備注1010.10.01-90接種水樣總量

27、為11.11（10，1，0.1，0.01 mL各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220+-230-+280+-+920+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數備注1001010.1-9接種水樣總量為111.1（100，10，1，0.1ml各一份）-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380表7 大腸菌群變異不大的水源水陽性管數012345678910每

28、升水樣中大腸菌群數10112236516992120160230230備注接種水樣總量100mL(10ml10份)操作步驟同生活用水或食品生產用水的檢驗。同時應注意，接種量1ml及1ml以內用單倍乳糖膽鹽發酵管；接種量在1ml以上者，應保證接種后發酵管(瓶)中的總液體量為單倍培養液量。然后根據證實有大腸菌群存在的陽性管(瓶)數，查表4、表5、表6或表7，報告每升水樣中的大腸菌群數(MPN)。附：濾膜法濾膜法所使用的濾膜是一種微孔濾膜。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的濾器中，經過抽濾，細菌即被均勻地截留在膜上，然后將濾膜貼于大腸菌群選擇性培養基上進行培養。再鑒定濾膜上生長的大腸菌群的菌落，計算出每升

29、水樣中含有的大腸菌群數(MPN)。(1)準備工作：1)濾膜滅菌：將3號濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中蒸煮滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需換無菌水洗滌2-3次，以除去殘留溶劑。2)濾器滅菌：準備容量為500ml的濾器，用點燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用121高壓滅菌20min。3)培養：將品紅亞硫酸鈉培養基放入37培養箱內預溫30-60min。(2)過濾水樣：1)用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將祖糙面向上貼放于已滅菌的濾床上，輕輕地固定好濾器漏斗。水樣搖勻后，取333ml注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在50kPa壓力下進行抽濾。2)水樣濾完后再抽氣約5s，關上濾器閥門，取下濾

30、器，用無菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基上，濾膜截留細菌面向上與培養基完全緊貼，兩者間不得留有間隙或氣泡。若有氣泡需用鑷子輕輕壓實，倒放在37培養箱內培養16-18h。(3)結果判定：1)挑選符合下列特征的菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。紫紅色，具有金屬光澤的菌落。深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。淡紅色，中心顏色較深的菌落。2)凡是革蘭氏陰性無芽胞桿菌，需再接種于乳糖蛋白胨半固體培養基，37培養6-8h，產氣者，則判定為大腸菌群陽性。3)1L水樣中大腸菌群數等于濾膜法生長的大腸菌群菌落數乘以3。實驗四、微生物的快速鑒定和自動化分析技術如何使微生物學技術方法快速、準確、簡易和自動化，

31、一直是微生物學工作者研究的熱點，尤其是臨床醫學方面，對微生物的快速準確鑒定，更是"時間就是生命"。近20多年來，隨著微電子、計算機、分子生物學、物理、化學等先進技術向微生物學的滲透和多學科的交叉，這方面已取得了突破性進展，許多快速、準確、敏感、簡易、自動化的方法技術，不僅在微生物鑒定中廣為使用，而且在微生物學的其它方面也被采用，推動了微生物學的迅速發展。一、微量多項試驗鑒定系統該系統的根本原理是根據微生物生理生化特征鑒定的結果，而進行的數碼分類鑒定。這種技術也稱為簡易診檢技術，或數碼分類鑒定法。它是針對微生物的生理生化特征，配制各種培養基、反應底物、試劑等，分別微量（約0.

32、1ml）加入各個分隔室中（或用小圓紙片吸收），冷凍干燥脫水或不干燥脫水，各分隔室在同一塑料條或板上構成檢測卡。試驗時加入待檢測的某一種菌液，培養248小時，觀察鑒定卡上各項反應，按判定表判定試驗結果，用此結果編碼，查檢索表(根據數碼分類鑒定的原理編制成)，得到鑒定結果，或將編碼輸入計算機，用根據數碼分類鑒定原理編制的軟件鑒定，打印出結果。微量多項試驗鑒定系統已廣泛用于動、植物檢疫、臨床檢驗、食品衛生、藥品檢查、環境監測、發酵控制、生態研究等方面，尤其是臨床檢驗中深受歡迎，迅猛發展。國際上此技術的產品，或稱系統，種類繁多，國內有河南開封醫學生物研究所的腸桿菌科細菌鑒定卡E-15；上海市衛生防疫站

33、的發酵性革蘭氏陰性桿菌鑒定系統SWF-A；中國人民解放軍一八一醫院的厭氧菌快速生化鑒定系列ARB-ID；深圳華士達生物科技有限公司的腸桿菌科的細菌生化鑒定卡ENT等。國外的產品已標準化、系統化和商品化，主要有法國生物-梅里埃集團的API/ATB；瑞士羅氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美國的Biolog全自動和手動細菌鑒定系統：日本的微孔濾膜塊等，其中API/ATB包括眾多的鑒定系統，共計有750種反應，可鑒定幾乎所有常見的細菌。微量多項鑒測技術優點突出，不僅能快速、敏感、準確、重復性好地鑒檢微生物，而且簡易，節省人力、物力、時間和空間，缺點是各系統差異較大，有的

34、價格貴，有的個別反應不準，難判定，但毫無疑問，它是微生物技術方法向快速、簡易和自動化發展的重要方向之一。API20E系統是API/ATB中最早和最重要的產品，也是國際上應用最多的系統。該系統的鑒定卡是一塊有20個分隔室的塑料條，分隔室由相連通的小管和小環組成，各小管中含不同的脫水培養基、試劑，或底物等，每一分隔室可進行一種生化反應，個別的分隔室可進行兩種反應，主要用來鑒定腸桿菌科細菌，如圖1所示。圖1 API 20E鑒定卡示意圖鑒定未知細菌的主要過程：將菌液加入每一個分隔室；培養后，有的分隔室的小杯中需要添加試劑，觀察鑒定卡上20個分隔室中的反應變色情況，根據反應判定表（表1），判定各項反應是

35、陽性還是陰性反應；按鑒定卡上反應項目從左到右的順序，每三個反應項目編為一組，共編為七組，每組中每個反應項目定為一個數值，依次是1、2、4，各組中試驗結果判定的反應是陽性者記""，則寫下其所定的數值，反應陰性者記""，則寫為0，每組中的數值相加，便是該組的編碼數，這樣便形成了7位數字的編碼，表2為舉例說明；用7位數字的編碼查API20E系統的檢索表，或輸入計算機檢索，則能將檢驗的細菌鑒定出是什么菌種或生物型。表1 API20E反應判定表鑒定卡上的反應項目反 應 結 果 代 號項 目 名 稱陰 性陽 性ONPN-半乳糖苷酶無色黃ADH精氨酸水解黃綠紅，橘紅L

36、DC賴氨酸脫羧黃綠紅，橘紅ODC鳥氨酸脫羧黃綠紅，橘紅CIT枸椽酸鹽利用黃綠綠藍H2S產H2S無色黑色沉淀URE尿素酶黃紅紫TDA色胺酸脫氨酶黃紅紫IND吲哚形成黃綠紅VPV.P.試驗無色紅GEL蛋白酶黑粒黑液GLU葡萄糖產酸藍黃綠MAN甘露醇產酸藍黃綠INO肌醇產酸藍黃綠SOR山梨醇產酸藍黃綠RHA鼠李糖產酸藍黃綠SAC蔗糖產酸藍黃綠MEL密二糖產酸藍黃綠AMY淀粉產酸藍黃綠 ARA阿拉伯糖產酸藍黃綠表2 API20E舉例說明項目名稱ONPGADHLDCODCCITH 2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARA所定數值124124124124124

37、12412試驗結果+-+-+-+記下數值10412000010412412412編 碼5305773檢索結果5305773 產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）另一種應用廣泛的是Enterotube系統，可以稱為腸道管系統。它的鑒定卡是由帶有12個分隔室的一根塑料管組成，每個分隔室內裝有不同的培養基瓊脂斜面，能檢驗微生物的15種生理生化反應，一根接種絲穿過全部分隔室的各種培養基，并在塑料管的兩端突出，被兩個塑料帽蓋著，像一根火腿腸，如圖2所示。圖2 Enterotube系統示意圖 鑒定未知菌時，將塑料管的兩端帽子移去，用接種絲一端的突出尖端接觸平板上待鑒定的菌落中心，然后

38、在另一端拉出接種絲，通過全部分隔室，使所有培養基都被接種，再將一段接種絲插回到4個分隔室的培養基中，以保持其還原或厭氧條件。圖3示意腸道管系統的接種過程。培養后，有的分隔室也需加試劑。然后按API20E類似的步驟，觀察反應變色情況，判定試驗結果陰性或陽性，寫出編碼數，形成5位數的編碼，因12個分隔中有3個分隔中的培養基都能觀察到2種生化反應，此腸道管系統共15個反應，可分為5個組。根據編碼查腸道管系統的索引，或用計算機檢索，獲得鑒定細菌的種名或生物型。圖3 Enterotube系統的接種過程有一種可攜帶的檢測水中大腸菌數的大腸菌測試卡，即微孔（Milliporo）濾膜菌落計數板（圖4）。它是在

39、一塊拇指大小的塑料板上，裝有一薄層脫水干燥的大腸菌選擇鑒定培養基，其上覆蓋微孔濾膜(0.45m)，整個塑料板有一外套。檢測時，脫下外套，將塑料板浸入受檢水中約半分鐘，濾膜僅允許1毫升水進入有培養基的一邊，干燥的培養基則吸水溶解，擴散與濾膜相連，而1毫升水中的大腸菌則滯留在膜的另一邊，再將外套套上，培養12-24小時，統計濾膜上形成的蘭或綠色菌落數。菌落的多少可以表明水中污染大腸菌群的狀況。該測定卡攜帶和培養都方便，適于野外工作和家庭使用，因可以放在人體內衣口袋中培養。置換塑料板上的培養基，可以制成檢測各種樣品的微孔濾膜塊。圖4 大腸菌測試卡示意圖國際上常用的6種微量多項試驗鑒定系統的優、缺點比

40、較，見表3。表3 6個鑒定系統的優、缺點比較特 點EnterotubeR/BAPI20EMinitekPathoTecMicroID準確性(和常規法比較)95%9098%9398%91100%95%95+%診檢時間(小時)182418241824182444最后報告時間(小時)4848484824302430系統的簡單性簡單簡單不簡單較簡單不簡單較簡單底物載體培養基培養基脫水培養基圓紙片紙條圓紙片試驗項目數15142014(35)1215 選擇性良好良好良好很好一般良好不夠穩定的項目檸、尿乳、葡/氣 DNaseH2S、賴、鳥、檸H2S尿、七賴、山、肌實驗五、抗微生物藥物敏感性試驗一、實驗目的抗

41、微生物藥物敏感性試驗（藥敏試驗）的主要目的檢出細菌的耐藥性，預測抗微生物藥物的臨床治療效果，并為臨床醫生針對某一特定的臨床感染選用藥物提供依據。對所有臨床分離的可疑致病菌，如不能從該菌的種屬特征可靠地推知其對抗菌藥物的敏感性，就需要進行藥敏試驗。紙片擴散法二、實驗原理此法是臨床和實驗室標準化研究所（CLSI/NCCLS）所推薦的臨床微生物理學室常規開展的藥敏試驗方法。將含有定量抗菌藥物的紙片（藥敏紙片）貼在已接種待檢菌的瓊脂平板表面特定部位。藥物借其分子的擴散力向周圍瓊脂中擴散，形成了隨著離紙片距離加大，瓊脂中的藥物濃度逐漸減少的梯度濃度。其紙片周圍一定區域瓊脂內的藥物濃度高于抑制待檢菌所需濃

42、度時，則該區域內細胞不能生長，形成透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待檢對測定藥物的敏感程度，并與該藥對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關，即抑菌圈愈大，MIC愈小。三、實驗器材和試劑1菌種 金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853或臨床分離的菌株。2培養基 MH（Mueller-Hintion）瓊脂。3試劑 無菌生理鹽水，0.5麥氏標準比濁管（McFarland standard，相當于1.5×108CFU/ml），抗菌藥物紙片：選用直徑6.35mm吸水量20l的專用藥敏紙片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨芐西林

43、（AMP）、哌拉西林（PIP）、頭孢唑啉（FZN）、頭孢呋辛（FRX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IMP）、環丙沙星（CIP）、萬古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、復方新諾明（SXT）。4其他 無菌棉拭子、鑷子、毫米尺、接種環。四、方法步驟1菌液制備（1）對數生長法：從瓊脂平板上選取至少3-5個形態特征一致的菌落，用接種環轉移至含45ml的肉湯培養管（如胰酶消化大豆肉湯）中，35孵育2-6h。用無菌鹽水或肉湯調整菌液濁度相當于0.5麥氏標準。（2）直接菌落法：從孵育18-24h的非選擇性培養基（如血瓊脂）平板上，挑取單個菌落，直接用肉湯或無

44、菌鹽水制成0.5麥氏標準濁度的懸液。2接種 細菌懸液制備后15min內接種至MH瓊脂平板。用無菌棉拭醮取菌懸液，在管內壁液面上方旋轉緊壓，將多余菌液擠去，最后沿平板內緣涂抹一周。3貼藥敏紙片 涂布后的平板在室溫下干燥3-5min，用紙片分配器或無菌鑷子將紙片貼于瓊脂表面并輕壓，使紙片與瓊脂表面完成接觸。各紙片中心相距應大于24mm，紙片貼上后就不能再移動位置。4孵育將平板倒置放入35孵箱（苛養菌敏平板應放置于5%-10%CO2環境中），16-18h讀取結果，葡萄球菌和腸球菌必須孵育24h以檢測對苯唑西林和萬古霉素的耐藥性。五、結果判斷抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數報告（取整數）。根據

45、CLSI判定標準測量抑菌圈直徑大小可以判斷細菌對該抗生素是敏感、中介還是耐藥。敏感（S）：表示常規劑量的測定藥物在體內所達到的濃度能抑制或殺滅待測菌。中介（I）：不是敏感性的度量，而是一個“緩沖區”，用以防止因微小的技術因素失控導致的結果偏差，因而其臨床意義是不確定的，故不應作臨床報告。耐藥（R）：表示常規劑量的測定藥物在體內達到有效濃度時不能抑制待測菌生長。六、藥敏試驗結果判斷注意事項（1）藥敏試驗的結果容易受培養基、抗菌藥物、孵育條件等多種因素影響，實驗室開展藥敏試驗時應定期用標準菌株對上述因素進行質量控制。（2）變形桿菌屬的菌株可擴散到某些抗菌藥物的抑菌圈內，所以在明顯的抑菌圈內有薄膜樣

46、爬行生長可以忽略。（3）對于鏈球菌應檢測生長抑制圈而不是溶血抑制圈。對于甲氧芐啶和磺胺，拮抗物可使細菌輕微生長，所以抑菌圈直徑的檢測不考慮細微生長的部分（生長菌苔的20%或以下）而測量比較明顯的邊緣。（4）對于沙門菌屬和志賀菌屬的分離株只有氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和磺胺甲唑/甲氧芐啶可用于常規試驗和報告，第一、第二代頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素體外可能對這些菌株有活性，但臨床卻無效，所以對上述藥物不應報告為敏感。（5）沙門菌屬的腸道外分離株應測試并報告氯霉素和一種三代頭孢菌素的敏感性。（6）腸球菌屬對頭孢菌素類、氨基糖苷類（僅篩選高水平耐藥性）、磺胺甲 唑/甲氧芐啶和克林霉素在體外可能有活性，

47、但在臨床上耐藥，所以不能報告對這些藥物敏感。對抑菌環大小的解釋標準七、影響藥敏結果的因素1.培養基：應根據試驗菌的營養需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。2.細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。3.藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。4.培養時間：一般培養溫度和時

48、間為37 8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4冰箱內2-4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。八、思考題1.操作藥敏試驗并說出注意事項。2.試述藥敏試驗的意義？3.如何根據藥敏試驗的結果選擇藥物？4.什么叫抑菌圈？如何根據抑菌圈大小判斷細菌對藥物的敏感度？九、實驗報告附：干燥抗菌紙片的制備取直徑6mm的無菌濾紙片，浸于一定濃度的抗菌藥液中，一般每毫升抗菌藥液中，裝濾紙片100片，浸泡12h后，37干燥或真空干燥，密封冷藏備用。實驗六、微生物的生理生化反應微生物生理生化反應的多樣性在自然界產生了兩種結果:

49、第一是使自然界的有機分子都有可能得到分解;第二是使不同微生物之間有了互相作用和互相依賴的基礎.例如,一種微生物能利用另一種微生物所分解的產物,或者一種微生物的產物可抑制或殺死另一種微生物.所以微生物的生理生化反應也被作為細菌鑒定和分類的內容。一、大分子物質的水解試驗(一)目的要求1.證明不同微生物對各種有機大分子的水解能力不同,從而說明不同微生物有著不同的酶系統。2.掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。(二)基本原理微生物對大分子的淀粉,蛋白質和脂肪不能直接利用,必須靠產生的胞外酶將大分子物質分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質為較小的化合物,使其能被運輸至

50、細胞內.如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精,雙糖和單糖;脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白質為氨基酸等.這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質變化來證實:淀粉遇碘液會產生藍色,但細菌水解淀粉的區域,用碘測定不再產生藍色,表明細菌產生淀粉酶.脂肪水解后產生脂肪酸可改變培養基的pH,使pH降低,加入培養基的中性紅指示劑會使培養基從淡紅色變為深紅色,說明胞外存在著脂肪酶。微生物可以利用各種蛋白質和氨基酸作為氮源外,當缺乏糖類物質時,亦可用它們作為碳源和能源.明膠是由膠原蛋白經水解產生的蛋白質,在25以下可維持凝膠狀態,以固體形式存在.而在25以上明膠就會液化.有些微生物可產生一種稱作明膠酶的胞

51、外酶,水解這種蛋白質,而使明膠液化,甚至在4仍能保持液化狀態。還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測.石蕊培養基由脫脂牛奶和石蕊組成,是昏濁的藍色.酪素水解成氨基酸和肽后,培養基就會變得透明.石蕊牛奶也常被用來檢測乳糖發酵,因為在酸存在下,石蕊會轉變為粉紅色,而過量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解會引起堿性反應,使石蕊變為紫色.此外,某些細菌能還原石蕊,使試管底部變為白色。尿素是由大多數哺乳動物消化蛋白質后被分泌在尿中的廢物.尿素酶能分解尿素釋放出氨,這是一個分辨細菌很有用的診斷實驗.盡管許多微生物都可以產生尿素酶,但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬(P

52、roteus)的細菌要慢,因此尿素酶試驗被用來從其他非發酵乳糖的腸道微生物中快速區分這個屬的成員.尿素瓊脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚紅.酚紅在pH6.8時為黃色,而在培養過程中,產生尿素酶的細菌將分解尿素產生氨,使培養基的pH升高,在pH升至8.4時,指示劑就轉變為深粉紅色。(三)器材1.菌種 枯草芽胞桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),普通變形桿菌。2.培養基 固體油脂培養基,固體淀粉培養基,明膠培養基試管,石蕊牛奶試管,尿素瓊脂試管。3.溶液或試劑 革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol's iodine solution)。

53、4.儀器或其他用具 無菌平板,無菌試管,接種環,接種針,試管架。(四)操作步驟l.淀粉水解試驗(1)將固體淀粉培養基溶化后冷卻至50左右,無菌操作制成平板。(2)用記號筆在平板底部劃成四部分。(3)將枯草芽孢桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種,在平板的反面分別在四部分寫上菌名。(4)將平板倒置在37溫箱中培養24h。(5)觀察各種細菌的生長情況,將平板打開蓋子,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,輕輕旋轉平板,使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明圈,說明淀粉己被水解,為陽性.透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱,即產生胞外淀粉酶活力的高低。2.油脂水解試驗(1)將溶化的固體油脂培養基冷卻至50左右時