1、指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液質(zhì)量控制中的研究進(jìn)展【摘要】 目的：綜述指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液中的應(yīng)用現(xiàn)狀，總結(jié)存在的問題，并提出對(duì)策。方法：檢索近年有關(guān)清開靈注射液指紋圖譜研究的文獻(xiàn)，并對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分類、總結(jié)和分析。結(jié)果與結(jié)論：各種指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液的質(zhì)量控制中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但仍然存在一些問題，有待于進(jìn)一步深入研究，建立更加全面的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。【關(guān)鍵詞】 指紋圖譜；清開靈注射液；質(zhì)量控制；研究進(jìn)展The research progress in the quality control of Qingkailing Injections with fingerprint techno

2、logyAbstract Objective: To analyze the current status of applying fingerprint technology to quality control of the Qingkailing Injections. To conclude the existing problems in the Qingkailing Injections and put forward solutions to solve it. Methods: A literature review was conducted and the methods

3、 of classification and summarization were applied. Results and Conclusion: Fingerprint technology is widely used in quality control of Qingkailing Injections. However, more research work is still needed to set up full-scale standards.Keywords fingerprint; Qingkailing Injections; quality control; res

4、earch progress中國醫(yī)藥源遠(yuǎn)流長，從神農(nóng)嘗百草開始，至今已有數(shù)千年歷史。隨著醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，新的中藥劑型不斷出現(xiàn)，特別是中藥注射液的出現(xiàn)及其在臨床上的廣泛應(yīng)用，為中藥現(xiàn)代化開辟了新的道路，但目前我國中藥注射液的質(zhì)量控制水平較低，無法適應(yīng)其未來發(fā)展的要求，中藥的現(xiàn)代化、國際化“瓶頸”就在質(zhì)量控制上1。由于歷史發(fā)展的局限性中醫(yī)中藥學(xué)在許多方面還停留在“知其然而不知其所以然”的階段。近年來，由于對(duì)中藥內(nèi)在成分的穩(wěn)定性、一致性和相對(duì)可控性不夠明確，從而造成臨床療效的一致性、穩(wěn)定性也較差的現(xiàn)象。針對(duì)這種情況我國全力開發(fā)中藥指紋圖譜技術(shù)，而且在2000年8月國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布了中藥注射

5、劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）2，要求對(duì)目前已經(jīng)生產(chǎn)的所有注射液進(jìn)行指紋圖譜研究，指紋圖譜技術(shù)可用于中藥注射劑的多組分、多指標(biāo)的定性、定量分析。發(fā)達(dá)國家已認(rèn)可了這個(gè)技術(shù)對(duì)中藥注射液的適用，所以這是實(shí)現(xiàn)中藥國際化的關(guān)鍵技術(shù)。本文將對(duì)近年來各種指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。清開靈注射液是由古方安宮牛黃丸通過拆方改制而成的一種中藥注射液3，是臨床必備中藥注射液之一，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)、醒神開竅的功效，用于治療熱病神昏、中風(fēng)偏癱、神志不清等癥。處方由牛黃、珍珠母、板藍(lán)根、水牛角、黃芩、梔子、金銀花共7味藥組成。其中牛黃通過直接加入牛膽酸鈉和豬去氧膽酸鈉來代替；黃芩通過直接加入含量9

6、0%以上的黃芩苷代替；另外，梔子、金銀花和板藍(lán)根這3味藥材通過藥材提取液的形式入藥；水牛角和珍珠母2味藥材水解入藥，水解液主要含有無機(jī)元素、氨基酸和少量多肽。所以在整個(gè)注射液中，存在無機(jī)離子、有機(jī)小分子以及生物大分子等各種化學(xué)物質(zhì)，因此對(duì)于各種化學(xué)成分的特征，需要進(jìn)行多種現(xiàn)代分析儀器的聯(lián)合測定來完成，運(yùn)用色譜法、光譜法、質(zhì)譜法以及其他指紋圖譜技術(shù)的聯(lián)用來建立清開靈注射液指紋圖譜體系，為清開靈的質(zhì)量控制提供依據(jù)。1中藥指紋圖譜的概念和建立方法中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥經(jīng)過處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)志中藥材或中成藥特征的色譜或光譜圖譜4-7。中藥指紋圖譜是一種整體的質(zhì)量控制方

7、法，是當(dāng)前最符合中藥特色的評(píng)價(jià)中藥真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的可行方法。中藥指紋圖譜按分析手段的不同可分為中藥生物指紋圖譜和中藥化學(xué)指紋圖譜，狹義的中藥指紋圖譜就是指中藥化學(xué)成分指紋圖譜。中藥化學(xué)指紋圖譜目前主要包括薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、超臨界流體色譜(SFC)、高效毛細(xì)管電泳色譜(HPCE)、紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、核磁共振譜(HMR)、質(zhì)譜(MS)、掃描電鏡指紋譜(SEM)、X射線指紋譜(XRD)、DNA指紋譜、以及采用多種現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用方式得到的多維多信息特征譜等8。2 指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液質(zhì)量控制中的應(yīng)用2.1色譜法2.1.1高

8、效液相色譜法李建明，張綱等人9運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)清開靈注射液生產(chǎn)中板藍(lán)根提取液的氨基酸種類進(jìn)行分析，他們通過對(duì)HPLC指紋圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根提取液中至少含有15種氨基酸，其中精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和丙氨酸的含量最高。該方法為強(qiáng)化清開靈注射液生產(chǎn)的過程控制和提高產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了研究思路。梔子作為清開靈注射液中主要的成分之一，其質(zhì)量的控制對(duì)清開靈注射液的安全性具有重要的作用。現(xiàn)在在梔子的質(zhì)量控制中很多運(yùn)用可變波長下的HPLC指紋圖譜技術(shù)10-11。可變波長下的HPLC指紋圖譜能夠有效地檢測梔子的質(zhì)量，克服了單波長檢測時(shí)信息量有限的缺點(diǎn)，能全面、真實(shí)地揭示中藥材的內(nèi)在質(zhì)量特征。清開

9、靈注射液中氨基酸種類眾多，為了使其質(zhì)量更加可控，白玉靜、高曉燕等12人運(yùn)用HPLC-ELSD法測定清開靈注射液中的氨基酸種類，該方法得到的HPLC指紋圖譜中有19個(gè)峰，也就是說該方法能夠測得清開靈注射液中含有19種氨基酸，通過HPLC指紋圖譜以各種氨基酸峰面積對(duì)數(shù)值Y為縱坐標(biāo)，氨基酸進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值X為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程可以對(duì)其進(jìn)行含量測定，而且該方法不需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生，省去了衍生反應(yīng)所需要的繁瑣步驟，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。2.1.2薄層色譜法中藥材是生產(chǎn)注射液的原材料，其質(zhì)量的好壞直接影響注射液的質(zhì)量。薄層色譜(TLC)是一種成熟的理化手段，在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的薄層掃描技術(shù)可對(duì)中藥特

10、定組分進(jìn)行定性和定量分析13。葉文婷、盧綿等人采用薄層色譜法對(duì)十種不同地區(qū)板藍(lán)根中核苷類成分進(jìn)行定性測定14，分別取各供試品溶液、對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板上。以氯仿-乙酸乙酯-異丙醇-水-濃氨水 (8:2:6:0.3:0.2)為展開劑，展開，取出晾干。置紫外光燈254 nm下檢視，供試品色譜與對(duì)照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同的顏色斑點(diǎn)。結(jié)果表明，十種不同產(chǎn)地的板藍(lán)根中均含有尿苷、腺苷、腺嘌呤。該方法的重現(xiàn)性好，分離度好，薄層斑點(diǎn)清晰，而且方法簡單靈敏，準(zhǔn)確可靠，可完善現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高板藍(lán)根的質(zhì)量控制，對(duì)于保證其質(zhì)量和臨床療效具有重要意義。色譜法反映的是中藥注射液以及中藥材提取物的化

11、學(xué)組成及含量狀況，其特點(diǎn)是分離能力強(qiáng)、分析速度快、定量準(zhǔn)確，能定性定量地反映不同中藥間的差異，而且根據(jù)各種色譜方法得到的指紋圖譜準(zhǔn)確、可靠。依據(jù)國家對(duì)中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求，采用色譜法對(duì)清開靈注射液進(jìn)行指紋圖譜研究，建立清開靈注射液色譜指紋圖譜體系，為清開靈注射液的質(zhì)量控制提供有效方法是目前我國研究的重點(diǎn)之一15-19。2.2光譜法2.2.1紫外光譜法王麗婷、王麗娟等運(yùn)用紫外光譜法對(duì)金銀花中的木犀草素進(jìn)行鑒定20，他們采用試驗(yàn)品木犀草素和樣品對(duì)照的方法進(jìn)行紫外圖譜鑒定，只要試驗(yàn)品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰重合的相對(duì)較好，就是純度較高的木犀草素產(chǎn)品。運(yùn)用紫外光譜法我們可以快速的得出中藥材中的特定

12、成分是否合格，是否符合藥品生產(chǎn)所需，對(duì)控制清開靈注射液的質(zhì)量具有重要意義。紫外光譜法具有簡便、快速、可多組分測定等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于液體試樣的過程分析與質(zhì)量控制。清開靈注射液成分眾多，各成分的紫外特征吸收差異較小，各組分的紫外光譜存在嚴(yán)重的重疊，限制了該方法的直接應(yīng)用，但結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)光譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可以對(duì)清開靈注射液進(jìn)行高效的質(zhì)量控制21-22。2.2.2紅外光譜法紅外光譜的運(yùn)用對(duì)鑒定藥品的真?zhèn)巍⒖刂扑幤返馁|(zhì)量具有重要的意義。李洪宇、張麗華等23建立用于鑒別牛黃解毒丸的紅外指紋特征圖譜，他們對(duì)所有樣品采用統(tǒng)一的提取條件，采用丙酮提取并測試其提取物的紅外指紋圖譜。經(jīng)數(shù)據(jù)分析不同廠家牛黃解毒

13、丸均具有獨(dú)特而穩(wěn)定的紅外指紋特征圖譜，并與偽品區(qū)別明顯。因此牛黃解毒丸的紅外指紋特征圖譜可以作為其質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的根據(jù)。中藥鑒定在中藥注射液質(zhì)量控制中具有重要的作用，近年來多種現(xiàn)代儀器分析方法被用于中藥鑒定和質(zhì)量控制。作為一種簡單、快速、無損的檢測手段，近紅外光譜(NIRS)技術(shù)己成為中藥注射液定性判別和定量分析的新興方法24。朱向榮、李娜等應(yīng)用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法25，建立了清開靈注射液中間體總氮和梔子苷含量測定的新方法。他們對(duì)多批清開靈注射液的四混液樣本進(jìn)行透射方式采集光譜，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)程序?qū)庾V進(jìn)行處理分析，結(jié)果表明這種方法能夠快速、無損、可靠地測定四混液中總氮和梔子

14、苷的含量，該方法可推廣應(yīng)用于中藥注射液中間體的在線質(zhì)量控制。2.3多維圖譜技術(shù)的聯(lián)用2.3.1色譜-光譜技術(shù)的聯(lián)用建立清開靈注射液HPLC/UV/MS/MS指紋圖譜研究，對(duì)清開靈注射液的質(zhì)量控制具有非產(chǎn)重要的意義，嚴(yán)詩楷、羅國安、王義明等人建立了清開靈注射液HPLC/UV/MS/MS指紋圖譜26，研究了16個(gè)指紋峰，其中10個(gè)為共有峰，并通過電噴霧離子阱質(zhì)譜分析鑒定出其中13個(gè)主要色譜峰，部分結(jié)果用對(duì)照品進(jìn)行了保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜峰比對(duì)鑒定，成功區(qū)分了3種結(jié)構(gòu)相似的綠原酸類異構(gòu)體。HPLC/UV/MS/MS方法用于清開靈注射液研究，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)有效組分的良好分離并提供各指紋峰的組成和結(jié)構(gòu)信息。H

15、PLC/UV/MS/MS指紋圖譜準(zhǔn)確、可靠、有效，在中藥復(fù)雜體系研究及其質(zhì)量控制方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。為中藥復(fù)雜體系的分析及其質(zhì)量控制提供了一種有效、可靠的模式。2.3.2色譜-色譜技術(shù)的聯(lián)用北京中醫(yī)藥大學(xué)的白潔利用多維高效液相色譜法27測定的清開靈注射液十一種指標(biāo)性成分的總含量為7.74 mg/ml，占總固體量的24.1%。多維高效液相色譜法可以一次進(jìn)樣分析測得十一種指標(biāo)性成分含量，比以往的研究有了很大的進(jìn)步。所謂多維，即采用多種分析儀器聯(lián)用的模式來測定指紋圖譜，可對(duì)復(fù)雜的清開靈注射液有更清晰完整的認(rèn)識(shí)。高曉燕、李娜28-29等運(yùn)用反相高效液相和紫外光譜聯(lián)合的方法對(duì)清開靈注射液進(jìn)行在線

16、質(zhì)量控制，通過對(duì)反相高效液相色譜和紫外色譜的分析可以快速測定梔子苷的含量，同時(shí)他們只運(yùn)用高效液相色譜進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果表明，聯(lián)用的多維指紋圖譜比單一的高效液相色譜法能夠更準(zhǔn)確、全面、快速的測定清開靈注射液中梔子苷的含量。由于清開靈注射液的成分比較復(fù)雜，現(xiàn)行的各種單一測定方法得到的信息少，往往無法建立較完善的指紋圖譜，現(xiàn)在很多研究者建議建立多維指紋圖譜解決這類問題30-33。3 中藥注射液指紋圖譜研究中存在的問題及對(duì)策近些年來，指紋圖譜技術(shù)用于中藥注射液的質(zhì)量控制成為中藥研究的熱點(diǎn)，但是指紋圖譜技術(shù)并不是完美的，它也存在一些有待解決的問題。3.1 指紋圖譜測定條件不夠規(guī)范目前在清開靈注射液指紋圖譜研

17、究中較多的采用各種色譜法、光譜法及色譜光譜聯(lián)用的方法。但是這些方法在使用過程中受到很多因素的影響34，包括儀器自身穩(wěn)定性、樣品的前處理方法、色譜分析條件以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等，這些因素的變化都會(huì)影響到指紋圖譜的測定結(jié)果。目前在研究中更多關(guān)注的是圖譜條件，而沒有對(duì)其他條件予以嚴(yán)格控制，造成一些指紋圖譜在實(shí)際應(yīng)用過程中重現(xiàn)性很差。因此，在清開靈注射液指紋圖譜研究中應(yīng)該對(duì)測定條件進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范，除了對(duì)具體儀器設(shè)備條件進(jìn)行規(guī)范外，還要對(duì)樣品的前處理方法、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件等其他影響測定結(jié)果的因素進(jìn)行詳細(xì)記錄，必要時(shí)候還要考察樣品前處理方法及實(shí)驗(yàn)環(huán)境的變化對(duì)指紋圖譜的影響，這樣通過一定量的數(shù)據(jù)積累可以發(fā)現(xiàn)各種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)

18、結(jié)果的影響。清開靈注射液指紋圖譜測定過程的規(guī)范和控制，對(duì)保證清開靈注射液指紋圖譜的重現(xiàn)性和實(shí)用性具有重要意義。3.2 指紋圖譜技術(shù)手段不夠全面清開靈注射液是一個(gè)復(fù)雜體系，其中含有多類化學(xué)成分，這些成分中包含有效成分，也可能含有一些非有效成分，但這些成分作為一個(gè)起藥效作用的整體，就應(yīng)該全面控制其質(zhì)量，保證各種成分都處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，都處于可控的范圍內(nèi)35。這就要求對(duì)清開靈注射液的多種成分進(jìn)行全面質(zhì)量控制，而目前在清開靈注射液指紋圖譜的研究中多采用單一的指紋圖譜模式，難以全面控制注射液的質(zhì)量。比如采用紫外圖譜法制定清開靈注射液的指紋圖譜，對(duì)于沒有紫外吸收的成分就無法進(jìn)行控制；而采用氣相色譜法制定

19、的指紋圖譜對(duì)于非揮發(fā)性成分則沒有辦法進(jìn)行監(jiān)測。因此，對(duì)于清開靈注射液這樣一個(gè)相對(duì)而言比較特殊的中藥劑型，應(yīng)該采用多種指紋圖譜模式協(xié)同質(zhì)量控制的策略，由于紫外光譜法、紅外光譜法等光譜技術(shù)能夠反映體系的總體特征，而且也具有指紋性，可以用于中藥注射劑整體穩(wěn)定性的宏觀控制；而高效液相色譜法、氣相色譜法等色譜技術(shù)能夠?qū)χ饕煞诌M(jìn)行微觀控制；此外，通過核磁共振、X-射線衍射等技術(shù)也能從不同側(cè)面反映清開靈的整體特征。通過這些指紋圖譜技術(shù)的協(xié)同使用，可以在宏觀和微觀層次最大限度的保證清開靈注射液的質(zhì)量穩(wěn)定和可控36。3.3 指紋圖譜信息挖掘不夠深入目前各種指紋圖譜技術(shù)都已經(jīng)嘗試著用于清開靈注射液的指紋圖譜研究

20、，在指紋圖譜的建立方法上已經(jīng)沒有太大障礙，但在對(duì)指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理和信息挖掘方面還需要進(jìn)一步研究。現(xiàn)有研究多把計(jì)算指紋圖譜相似度作為主要研究目的，事實(shí)上在指紋圖譜上還有很多信息有待挖掘，到底中藥注射劑的功效成分為哪些色譜峰？如何采用更為合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)理論和計(jì)算器技術(shù)來構(gòu)建指紋特征更加明顯的指紋圖譜計(jì)算方法？各色譜峰間的比例關(guān)系對(duì)藥效有何影響？這些問題提示我們，清開靈注射液指紋圖譜的研究還需要深入下去，需要進(jìn)入指紋圖譜研究的高級(jí)階段。4 前景與展望近年來，隨著清開靈注射液臨床應(yīng)用的日益增多，不良反應(yīng)的報(bào)道也逐年增多，甚至引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者死亡，清開靈注射液的安全性問題引起了人們的關(guān)注37-

21、38。但是我們應(yīng)該看到，清開靈注射液作為中藥現(xiàn)代化的重要成果，在中醫(yī)臨床上有著廣泛的應(yīng)用，對(duì)保障國人的生命健康起著巨大的作用，其安全性問題通過進(jìn)一步的研究是可以得到有效解決的。對(duì)于清開靈注射液的發(fā)展前景39，首先，要注重清開靈注射液指紋圖譜的橫向拓展研究，采用多種色譜和光譜指紋圖譜手段，建立針對(duì)不同類型成分的多種指紋圖譜模式協(xié)同質(zhì)量控制的方法，全面控制注射液的質(zhì)量；其次，要探索進(jìn)行清開靈注射液指紋圖譜的縱向深入研究，主要包括注射液的譜效關(guān)系研究、活性成分的比例關(guān)系研究、注射液指紋圖譜的信息挖掘研究等。我們堅(jiān)信，隨著各種指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液質(zhì)量控制中的廣泛應(yīng)用，我們可以建立起一整套規(guī)范的指

22、紋圖譜研究方法，制定出能夠反映清開靈注射液質(zhì)量的指紋圖譜質(zhì)控體系。5結(jié)論通過論述我們可以知道指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制具有重要的作用，因此，我們要加快色譜、光譜等指紋圖譜技術(shù)在清開靈注射液物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效成分等方面的研究，并且要快速應(yīng)用到注射液的生產(chǎn)中來40。我們要通過對(duì)指紋圖譜的深入研究，挖掘出指紋圖譜的更多信息，建立清開靈注射液指紋圖譜信息數(shù)據(jù)庫，使清開靈注射液的質(zhì)量控制達(dá)到國際水平。我們相信在以后清開靈注射液質(zhì)量控制的技術(shù)中指紋圖譜的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛，而且指紋圖譜技術(shù)也將為清開靈注射液的穩(wěn)定性、安全性提供有力的保障，指紋圖譜技術(shù)必將為清開靈注射液走向世界打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。參

23、考文獻(xiàn)1 秦昆明,徐昭,蔡寶昌.指紋圖譜技術(shù)在中藥注射劑質(zhì)量控制中的應(yīng)用現(xiàn)狀J.亞洲社會(huì)藥學(xué),2009,4(1):60-64.2 國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)J.中成藥,2000,22(10):671-675.3 肖蘭,趙緒元.清開靈注射液的研究進(jìn)展J.中國藥房,2006,17(6):468-469.4 湯芳玲,蔡光明,袁波,等.中藥指紋圖譜技術(shù)研究現(xiàn)狀C.中藥制劑新工藝、新技術(shù)與產(chǎn)品質(zhì)量控制研究高級(jí)研討會(huì).2010,157-159.5 李松林,棘宏喜.中藥現(xiàn)代化之探索與實(shí)踐C.第二屆中國天然藥物研究與發(fā)展論壇.2008,31-41.6 劉文靜,張培軍.質(zhì)量控制

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