1、PCRPCR技術及腫瘤三項應用技術及腫瘤三項應用主講人：趙晶晶2015.7.31PCRPCR的基本原理的基本原理 變性,復性,半保留復制PCR三步曲三步曲 變性 9097 退火 4555 延伸 72左右聚合酶鏈式反應：聚合酶鏈式反應： 是一種放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。 循環次數循環次數 DNA的鏈數的鏈數 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億億 PCR循環次數與循環次數與DNA產量關系產量關系PCR特點：高效擴增、忠實復制特點：高效擴增、忠實復制實時熒光定量實時熒光定

2、量PCR 是一種在是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法。聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法。 實現了對DNA模板的定量而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強，能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點 。熒光定量熒光定量PCR的臨床應用的臨床應用年齡年齡老年，兒童，老年，兒童，新生兒新生兒 性別性別體重體重/ /身高身高 合并癥合并癥病程病程器官功能器官功能肝臟肝臟, , 腎臟腎臟, , 心臟心臟基因型基因型環境因素環境因素食物食物 / /吸煙吸煙 / / 合并用藥合并用藥藥物反應藥物反應7預警預警遺

3、傳相關疾病遺傳相關疾病疾病相關疾病相關遺傳缺損遺傳缺損藥物基因組學藥物基因組學關聯分析關聯分析藥物相關藥物相關遺傳缺損遺傳缺損預防預防個體化治療個體化治療HGPHGP啟動了個體化醫學啟動了個體化醫學/ /基因組醫學基因組醫學 治療方法開發治療方法開發基因治療基因治療 藥物治療藥物治療n人基因數：人基因數：22,00022,000n潛在藥靶：潛在藥靶：22,00022,000n現有藥靶：現有藥靶：5005008個體化藥物治療的目的個體化藥物治療的目的 避免藥物不良反應避免藥物不良反應 最大化藥物效應最大化藥物效應 選擇有效個體選擇有效個體p EGFR基因突變檢測基因突變檢測p KRAS基因突變檢

4、測基因突變檢測p BRAF基因突變檢測基因突變檢測p 二氫嘧啶脫氧酶（二氫嘧啶脫氧酶（DPD）基因突變檢測）基因突變檢測p UGT1A1基因多態性檢測基因多態性檢測PCR技術在腫瘤個性化治療中的應用 肺癌居于我國惡性腫瘤死亡率之首，每年新增60萬患者，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占85%。 EGFR 表皮生長因子受體; 是上皮生長因子細胞增值和信號傳導的受體；與腫瘤細胞的增殖，血管生成，腫瘤侵襲，轉移及細胞凋亡抑制有關。 KRAS 鼠類肉瘤病毒癌基因；是細胞信號內傳導途徑中的一種信號傳導蛋白；像是體內的一個開關，正常時可以抑制腫瘤細胞生長，一旦突變，就會刺激細胞生長，打亂規律，從而導致腫瘤的

5、發生。 BRAF 是一種癌基因，是EGFR通路中的重要轉導因子，參與調控細胞生長，分化和凋亡等多種生理過程。 腫瘤三項腫瘤三項12TKTK細胞存活細胞存活(抗細胞凋亡抗細胞凋亡)PI3-KSTAT3AKTPTENMEK基因轉錄基因轉錄MAPK細胞增殖細胞增殖/分化分化化療化療/放療抵抗放療抵抗血管增生血管增生腫瘤細胞遷移擴散腫瘤細胞遷移擴散pYpYRAS RAFSOSGRB2pYG1SMG2l非小細胞肺癌非小細胞肺癌(NSCLC) (NSCLC) 組織中組織中EGFREGFR高表達；高表達；lEGFREGFR對腫瘤的增殖、分化、遷對腫瘤的增殖、分化、遷移等起重要作用移等起重要作用l抑制抑制EG

6、FREGFR活性可阻斷下游的信活性可阻斷下游的信號傳導，抑制腫瘤細胞生長、號傳導，抑制腫瘤細胞生長、轉移和血管增生，促進腫瘤細轉移和血管增生，促進腫瘤細胞凋亡胞凋亡表皮生長因子受體（表皮生長因子受體（EGFREGFR）用于檢測肺癌、結直腸癌等惡性腫瘤患者腫瘤組用于檢測肺癌、結直腸癌等惡性腫瘤患者腫瘤組織織EGFR（表皮生長因子受體）基因的突變情況。（表皮生長因子受體）基因的突變情況。EGFR突變檢測可協助醫生選擇易瑞沙（突變檢測可協助醫生選擇易瑞沙（Iressa，Gefitinib，吉非替尼，吉非替尼)、特羅凱（、特羅凱（Tarceva，它賽，它賽瓦；瓦；Erlotinib，厄洛替尼）等靶向藥

7、物的有效人，厄洛替尼）等靶向藥物的有效人群。群。EGFR突變的患者建議使用該類藥物治療，突變的患者建議使用該類藥物治療，無突變者不建議使用該類靶向藥物。無突變者不建議使用該類靶向藥物。EGFREGFR基因突變檢測是基因突變檢測是NSCLCNSCLC靶向用藥的必檢項目靶向用藥的必檢項目 K-ras基因是編碼一個基因是編碼一個GTP結結合蛋白的癌基因，其表達產物是合蛋白的癌基因，其表達產物是EGFR信號傳導通路上的重要蛋信號傳導通路上的重要蛋白。白。 K-ras基因突變一般會使結基因突變一般會使結直腸癌和肺癌患者絡氨酸激酶抑直腸癌和肺癌患者絡氨酸激酶抑制劑產生耐藥。制劑產生耐藥。判斷腫瘤的發生發展

8、、預后以及了解腫瘤的治療效果：判斷腫瘤的發生發展、預后以及了解腫瘤的治療效果：1.1.正常人血中檢出正常人血中檢出KrasKras基因異常，提示存在腫瘤易感性；基因異常，提示存在腫瘤易感性；2.2.良性腫瘤患者檢出良性腫瘤患者檢出KrasKras基因突變基因突變, ,提示有惡變的可能；提示有惡變的可能；3.3.KrasKras基因突變陽性，即使病理組織學診斷淋巴結轉移陰基因突變陽性，即使病理組織學診斷淋巴結轉移陰性，癌癥復發的可能性也很高；性，癌癥復發的可能性也很高；4.4.美國國立癌癥綜合網絡美國國立癌癥綜合網絡(NCCN)(NCCN)腫瘤臨床指南及其中腫瘤臨床指南及其中譯版均明確指出：只有

9、譯版均明確指出：只有K-K-rasras野生型患者才建議接受靶向野生型患者才建議接受靶向藥物的治療，突變型患者不建議進行分子靶向治療。藥物的治療，突變型患者不建議進行分子靶向治療。5.5.檢測檢測KrasKras基因突變可篩選用藥人群，實現腫瘤患者的個基因突變可篩選用藥人群，實現腫瘤患者的個體化治療，延長患者生存期。體化治療，延長患者生存期。17增殖增殖野生野生KRAS EGFR西妥昔單抗西妥昔單抗細胞內細胞內細胞外細胞外細胞膜細胞膜野生型野生型K-rasK-ras野生型的野生型的EGFREGFR通路通路K-rasK-ras突變型的突變型的EGFREGFR通路通路CTGGTGCCG增殖增殖突變

10、突變KRASEGFR西妥昔單抗西妥昔單抗細胞內細胞內細胞外細胞外細胞膜細胞膜突變型突變型無效應！無效應！KRAS突變為活化突變為活化突變，使增殖不受突變，使增殖不受上游信號控制上游信號控制n12、13(96%)和和61密碼子密碼子 n12號號35GA(甘甘天門冬）為主天門冬）為主CTGATGCCGnKrasKras基因是基因是RASRAS超家族中的原癌基因，超家族中的原癌基因，其編碼蛋白的激活其編碼蛋白的激活/ /失活受控于上游失活受控于上游EGFREGFR信號。信號。l單克隆抗體阻斷單克隆抗體阻斷EGFREGFR和和KrasKras蛋白蛋白等下游信號傳導通路，抑制和逆等下游信號傳導通路，抑制

11、和逆轉腫瘤的發生和發展。轉腫瘤的發生和發展。n突變型突變型KrasKras蛋白功能異常，無需蛋白功能異常，無需EGFREGFR活化信號刺激仍處于激活狀態，活化信號刺激仍處于激活狀態，且不可控而始終處于激活狀態，導且不可控而始終處于激活狀態，導致腫瘤的持續增殖。致腫瘤的持續增殖。l對抗對抗EGFREGFR藥物治療無效。藥物治療無效。黑色素瘤概況黑色素瘤概況 惡性黑色素瘤(黑色素瘤)是臨床上較為常見的皮膚粘膜和色素膜惡性腫瘤，也是發病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為35。2010年全球黑色素瘤新發病例199 627例，死亡例數為46372例1。 雖然黑色素瘤在我國發病率較低，但近年來成倍增長，每年新發病例約2萬例1。1CSCO黑色素瘤專家委員會，中國黑色素瘤診治指南(201 1版)，臨床腫瘤雜志2012年2月第17卷第2期BRAF基因與黑色素瘤基因與黑色素瘤 檢測我國468例原發黑色素瘤標本，BRAF突變率為25,9其中BRAFV600E是最常見的突變位點(87)，這為中國患者使用BRAFV600E抑制劑(Vemurafenib)提供了理論基礎1。 B-raf基因V600E突變導致抗EGFR抗體或EGFR酪氨酸激酶抑制劑類腫瘤靶向藥物的耐藥。 部分沒有 K-ras 基因突變的患者也會對 EGFR靶向藥物產生耐藥性，研究證明這主要是由于K-