DB12/T409-2009蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗方法微生物法Examinationofresidueofantibio天津市質量技術監督局發布I本標準的附錄A、附錄B為規范性附錄。本標準由天津市產品質量監督檢測技術研究院、太陽食品(天津)有限公司提出。本標準由天津市產品質量監督檢測技術研究院負責解釋。本標準由天津市質量技術監督局批準。本標準起草單位：天津市產品質量監督檢測技術研究院、太陽食品(天津)有限公司。本標準主要起草人：張潔、汪曉冬、高亦軍、陳相富、趙用花、劉順榮。本標準首次發布。心1蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗方法微生物法本標準規定了蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗的制樣及微生物抑制檢驗方法。本標準適用于蛋(蛋黃部分)與蛋制品(蛋黃制品)中抗生素殘留篩選檢驗。本標準不適用于蛋(蛋黃部分)與蛋制品(蛋黃制品)中抗生素殘留量的定量測定。修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。本方法根據抗生素對敏感菌的抑制作用，通過抑菌圈來判定是否含有抗生素。4.6游標卡尺：測量范圍0mm~200mm,精度0.02mm,或抑菌圈測量儀。4.7平皿：直徑(86±1)mm,底部平整光滑，經滅菌。4.11分析天平：感量0.1mg。4.12冰箱：0℃~8℃。4.13pH計：感量0.1。5.1.1藤黃微球菌MicrococcusluteusATCC9341,菌種的保存見附錄A。5.1.2枯草芽胞桿菌BacillussubtilisATCC6633,菌種的保存見附錄A。5.1.3蠟樣芽胞桿菌蕈狀變種BacilluscereusVar.mycoidesATCC11778,菌種的保存見附錄A。25.2.3檢測用培養基：抗生素培養基5號(AM5)、抗生素培養基8號(AM8)(配方見附錄B)。a)0.2mol/L檸檬酸溶液：稱取檸檬酸(C?H?O?)4.2g溶解在100mL蒸餾水中；b)0.5mol/L氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀(KOH)2.8g溶解在100mL蒸餾水中；c)混合液：0.2mol/L檸檬酸溶液和0.5mol/L氫氧化鉀溶液等量混合；d)檸檬酸一丙酮緩沖液體積比：混合液+丙酮+蒸餾水=35.3.1.2pH4.5磷酸緩沖液：稱取13.60g磷酸二氫鉀(KH?PO.)溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.3.1.3pH6.0磷酸緩沖液：稱取8.00g磷酸二氫鉀(KH?PO?)及2.00g磷酸氫二鉀(K?HPO?)溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.3.1.4pH8.0磷酸緩沖液：稱取0.52g磷酸二氫鉀(KH?PO?)及16.73g磷酸氫二鉀(K?HPO?)溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.3.2.1氨芐西林標準儲備液：稱取氨芐西林標準品10mg,用滅菌去離子水溶解并定容至1000Hg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用2d。5.3.2.2氨芐西林標準工作液：吸取250HL氨芐西林標準儲備液，用pH6.0磷酸緩沖液稀5.3.2.3卡那霉素標準儲備液：稱取卡那霉素標準品10mg,用滅菌去離子水溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用30d。5.3.2.4卡那霉素標準工作液：吸取400HL卡那霉素標5.3.2.5土霉素標準儲備液：稱取土霉素標準品10mg,用0.1mol/mLHCl溶解并定容置2℃~8℃冰箱中保存，可使用7d。5.3.2.7紅霉素標準儲備液：稱取紅霉素標準品10mg,用少量甲醇溶解，再用滅菌去離子水溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用30d。5.3.2.8紅霉素標準工作液：吸取250HL的紅霉素6.1.1將鮮蛋去殼，去掉蛋清，將蛋黃在濾紙上滾動、擦拭，盡可能去掉殘留蛋清，取蛋黃，攪勻，備用。6.2稱取15.0g混勻的試樣于100mL三角瓶中，加入檸檬酸--丙酮緩沖液60mL,充分振蕩混勻，過濾，濾液備用。濾液應確保其pH值在6.5～7.5之間。37.1.1藤黃微球菌ATCC9341菌懸液：將復蘇的菌種接種于盛有普通營養瓊脂的克氏瓶中，30℃±1℃培養18h~24h后，用滅菌生理鹽水完全洗下菌苔，制成菌懸液。置2℃~8℃冰箱中可保存15d。營養瓊脂的克氏瓶中，30℃±1℃培養7d,鏡檢芽胞數達到80%以上(如果達不到，可再培養數日，如培養10d以上，芽胞數仍達不到要求，菌種可能變異，不可使用。)|,用滅菌生理鹽水完全洗下菌苔，使其懸浮于生理鹽水中，65℃±1℃水浴加熱30min,經3000r/min離心20min,棄去上清液，如此重復洗滌芽胞兩次，然后用適量滅菌生理鹽水制成菌懸液。置2℃~8℃冰箱中可保存30d。把不同濃度藤黃微球菌ATCC9341菌懸液加入AM5培養基中，30℃±1℃培養18h后，使0.025Hg/mL氨芐西林標準工作液可產生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而獲得最適宜菌懸液用量。將經過確認的適宜濃度的菌懸液無菌吸取1mL加到溶化后冷卻至50℃左右的滅菌AM5培養基8mL中，充分混勻，保持水平使其凝固。制備好的平板置2℃~8℃冰箱中可保存2d～3d.那霉素標準工作液可產生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而獲得最適宜菌懸液用量。將經過確認的適宜濃度的菌懸液無菌吸取1mL加到溶化后冷卻至50℃左右的滅菌AM?培養基8mL中，充分混勻，保持水平使其凝固。制備好的平板置2℃~8℃冰箱中可保存2d～3d。土霉素標準工作液可產生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而獲得最適宜菌懸液用量。將經過確認的標準工作液，以檸檬酸-丙酮緩沖液作空白對照，待濾紙干后，把濾紙片以適當間隔置于平板上，每個平板最多不超過6片，用無菌鑷子輕壓使其固定，冷藏放置30min,再以30℃±1℃培養，18h后觀察如樣液在三種平板上均無抑菌圈，標準工作液的抑菌圈達到(14±1)mm,即報告“陰性”;如樣液在三種平板中任一平板上呈現抑菌圈，抑菌圈直徑小于12mm,大于10mm;檸檬酸-丙酮緩a)β-內酰胺類(氨芐西林):0.025mg/kg;4b)氨基糖苷類(卡那霉素):0.2mg/kg;c)四環素類(土霉素):0.05mg/kg;d)大環內酯類(紅霉素):0.05mg/kg。5(規范性附錄)普通營養瓊脂培養基中，經30℃±1℃培養18h~24h后，用滅菌脫脂棉塞密封冷藏保存。每隔30d至45d傳代一次。普通營養瓊脂培養基中，經30℃±1℃培養18h~24h后，分別接種于含有10%~20%脫脂乳的普通營養肉湯中，用滅菌脫脂棉塞密封后冷凍保存。需-70℃保存時，接種于含有10%～16%甘油的普通營養肉湯中；需-20℃保存時，接種于含有40%甘油的普通營養肉湯中。可保存90d。在制備菌懸液前，先將保存的標準菌種接種于普通營養肉湯中，30℃±1℃培養18h~24h后使用。(規范性附錄)c)蛋