第08講基因工程的基本操作程序

【學習目標】

第

【基礎知識】

一、目的基因的篩選和獲取

1.篩選合適的目的基因：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一，如Bt

基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的I的基因。

2.利用PCR獲取和擴增目的基因

（1）獲取目的基因的方法a.平合成（基因堿基序列是已知的）

b.PCR技術擴增（已知基因兩側的堿基序列）

c.從基因文庫中獲?。ㄔ松铮?/p>

（2）PCR技術

PCR的含義：是聚合酶鏈式反應的縮寫，它是一項根據DNA半保留復制的原理在體外提供參與DNA復制

的各種組分與反應條件，對目的基因的核昔酸序列進行大量兔制的技術。

基本條件,所：需要在一定的緩沖溶液中進行，其中一般要添加Mg2+

一模板：已知兩側堿基序列的DNA母鏈

原料：4種脫氧核甘酸

K：耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）

引物：是2種與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸

反應過程變性：加熱超過90℃,雙鏈DNA解旋為單鏈

復性：溫度下降至5（）℃左右，兩種引物與互補單鏈DNA結合

延伸：溫度上升到72℃左右，四種脫氧核甘酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下合成子鏈DNA

結果：兩引物間固定長度的DNA序列呈指數擴增（即2"）

鑒定PCR產物：用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定

注：1.含脫氧核甘酸鏈等長的DNA分子數為2n-2n

2.第三輪出現兩條鏈等長的DNA片段

3.兩種引物之間需要滿足的是：不能堿基互補配對，是防止引物之間結合形成雙鏈，降低引物與DNA

模板鏈結合的效率。

歸納總結

1、蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（BI抗蟲蛋白）為什么對人畜無害的原因：

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲揚道的堿性環境中才能表現出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞

也沒有特異性受體，不能穿透細胞膜殺死細胞。

2、基因文庫的概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌

分別含有這種生物的不同基因，成為基因文庫。

3、cDNA概念：以mRNA為模板進行逆轉錄形成的DNA

6、cDNA文庫和基因組文庫的比較：

文庫類型cDNA文庫基因組文庫

文庫大小小大

基因中啟動子無有

基因中內含子無有

基因多少某種基因的部分基因某種生物的全部基因

7、獲取目的基因的三種方法：①人工合成獲??；②從基因文庫獲?。虎弁ㄟ^PCR技術獲取

8、PCR技術：聚合酶鏈式反應的縮寫，是一項根據DNA半保留好制的原理，在體外提供參與DNA復制

的各種組分和反應條件，對目的基因的核昔酸進行大量亞制的技術。

9、引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。①體內復制的引物為RNA單鏈;

②體外復制的引物一般為DNA單鏈

10、PCR反應的條件：需要在一定的緩沖溶液中進行，需提供模板、引物、脫氧核昔酸、耐高溫的DNA聚

合酶（Taq酶）；同時需要控制溫度

11、運用PCR技術時，緩沖液中需要加入一定的反虺，激活DNA聚合酶

10、DNA體內復制的條件:

參與的組分在DNA復制中的作用

DNA母鏈提供DNA復制的模板

4種脫氧核甘酸合成DNA子鏈的原料

解旋酶打開DNA雙鏈

DNA聚合酶催化合成DNA子錐

引物使DNA聚合醯能夠從引物的3'端開始連接脫氧核甘酸

11、DNA體外更制（PCR）的條件

參與的組分在DNA復制中的作用

DNA母鏈提供DNA復制的模板

4種脫氧核甘酸合成DNA子鏈的原料

引物］

使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸

90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）

耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈

緩沖液（含Mg2+）激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶

不同的溫度變性、復性和延伸需要不同的溫度

12、PCR擴增的過程:

名稱具體內容

變性目的基因DNA受熱變性后形成單鏈

復性（退火）引物與單鏈相應互補序列結合

以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酹將溶液中四種脫氧核甘酸根據堿基互補配對

延伸

原則合成新的子鏈

13、PCR擴增的結果：每次循環后目的基因的量增加一倍，計算公式：2：,其中n為擴增循環的次數

14、擴增循環n次所需要的引物：計算公式：2^'-2,至少需要經過3次擴增以后才能得到目的基因，且擴

增第3次后能得到2個目的基因

15、PCR產物鑒定方法：采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產物

二、基因表達載體的構建

1.構建基因表達載體的目的a.q目的基因在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代

h使目的基因能夠表達和發揮作用

2.基因表達載體的構成：FI的基因+標記基因+啟動子+終止子

啟動子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合酶識別和結合的部位，

軀動基因轉錄出mRNA,有時為了滿足應用需要，會在載體中人工構建誘導型啟動

子，當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。

終止子：也位于DNA上在基因的下游，終止轉錄

起始密碼子和終止密碼子：位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束

再利用DNA通接.科目R雄皿方——

3.基因表達載體的構建過程（P80-圖3-6）年川被8T—個重但DNA分子（圖3-6）.

（1）首先用一定的限制酶切割載體

（2）然后用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶

切割含目的基因的DNA片段

（3）再利用DNA連接酶將含目的基因的DNA片段

拼接到載體的切口處

注意：選擇限制酶的三大原則一大要求（題干特定要求）

標記基因PstI

PstISmaIPstI

EcoRI

slaI抗病;因‘JRI

甲乙

（l）不能破壞目的基因如圖甲，可選擇PstI而不選擇SmaI

-（2）不能破壞質粒中的重要元件（如復制原點.啟動子.終止子.標記基因（至少保留一個））

（3）質粒與目的基因形成相同的黏性末端（?般使用雙酶切，比點是可以防止質粒和目的基因的自身

環化以及目的基因與載體的反向連接）

歸納總結

1.基因表達載體的功能：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，使目的基因能夠復制

和發揮作用

2.表達載體的組成：①復制原點；②目的基因；③標記基因；④啟動子；終止子（諧音記憶：一元買兩雞子）

3.扇動子：位于基因的上游?段有特殊序列結構的DNA片段，是RNA聚合酶以別和結合的部位，能驅動

基因轉錄產生所需的mRNA。

4.終止子：位于基因的下游的一段有特殊序列結構的DNA片段，終止轉錄

5.啟動子與起始密碼子、終止子與終止密碼子的區分：

項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子

位置基因的上游基因的下游mRNA上mRNA上

化學本質DNA序列DNA序列RNA序列RNA序列

RNA聚合酶識別和結

終止基因蛋白質合成開始的終止蛋白質合成

作用合的部位，啟動基因的

的轉錄信號（起點）（終點）

轉錄

6.構建重組質粒時只能用同?種限制酶切割目的基因和載體嗎？

不是，切割忖的基因和載體并非只能用同一種限制酶，如果兩種不同的限制酶切割后形成的黏性末端

相同，在DNA連接酶的作用下目的基因和載體也可以連接起來。

三、目的基因導入受體細胞

1.轉化的概念（重點）：目的基區進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。

2.常用的轉化方法

導入植物細胞農產菌轉化法（最常用）受體是體細胞或受精卵

花粉管通道法（我國獨創）如抗蟲棉

導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術受體細胞多是受精卵

導入微生物細胞：常以大腸桿菌作為受體細胞

一般先用Ca2+處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態（即感受態），

然后再將重組的基因表達載體導入其中。

3.重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達

農桿菌的特點：農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后能將Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）

轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。

歸納總結

1.轉化的概念：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。

2.將目的基因導入受體細胞的方法：

生物類型方法受體細胞過程特點

植物受粉一段時間后剪去

柱頭-＞滴加DNA溶液（含目

花粉管通道我國獨創的一

轉基因植物受精卵的基因）一目的基因借助花

法種方法

粉管通道進入受體細胞（胚

囊）一目的基因表達

將目的基因插入到農桿菌Ti

質粒的T-DNA片段上t

適用于雙子葉

農桿菌轉化體細胞或轉入農桿菌一用農桿菌侵

轉基因植物植物和裸子植

法受精卵染植物細胞一目的基因整

物

合到植物細胞染色體DNA

上一目的基因表達

提純含目的基因的表達載

目的基因導入

體T取卵（受精卵顯微注

轉基因動物顯微注射法受精卵動物細胞最有

射一胚胎早期發育，移植一

效的方法

獲得具有新性狀的動物

用Ca2+處理微生物細胞一＞

處于能吸收DNA分子的狀

Ca2+處理微生物態（即感受態細胞）一基因表簡便、經濟、有

轉基因微生物

法細胞達載體與感受態細胞混合效

一在一定溫度下促進感受

態細胞吸收DNA分子

四、目的基因的表達與檢測

1.分子水平的檢測1）］通過PCR等技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因

2）利用PCR技術檢測目的基因是否轉錄出了mRNA

3）用相應抗體進行抗原一抗體雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質等

2.個體生物學水平的鑒定：抗蟲.抗病接種試驗等

總結-基因工程的基本操作流程（P82-圖3-7）

獲取質粒、噬,用限制酶切割裁體、，

菌體等載體和含有目的基因的

DNA片段，然后用

篩選和獲取目DNA連接酶連接，

的基因構建基因表達載"

A佟|3-7基因工程的基本操作流程圖

歸納總結

類型檢測內容方法結果顯示

分子水平目的基因是否插入受體細胞是否擴增出目的

PCR技術

的檢測DNA上基因

目的基因是否轉錄出mRNAPCR技術

抗原一抗體雜交（蛋白質是否顯示出雜交

目的基因是否翻譯成蛋白質

和蛋白質之間）帶

個體生物學水對轉基因生物進行抗性是否賦予了預期

是否具有抗性及抗性程度

平的檢測接種實驗抗性

五、DNA片段的擴增及電泳鑒定

實驗原理：

LDNA片段的擴增：PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解旋與結合。

2.瓊脂糖凝膠電泳P54

（1）帶電粒子：DNA分子具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基因可以帶上正電荷或負電荷。

（2）電泳：在電場的作用下，帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。

（3）遷移速率：在凝膠中DNA分了?的遷移速率與凝膠的濃度.DNA分子的大小和構象有關。

（4）檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈卜.被檢測出來

3.操作提示P85注意

（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR試驗中使用的微量離心管.槍頭和蒸儲水等在使用前必須進行高

壓滅菌處理。

（2）緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20C儲存。使用前所需試劑從冰箱拿出放在冰塊上緩慢融化。

（3）添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。

（4）在進行操作時，一定要戴好一次性手套。

4.結果分析與評價

（1）未出現擴增條帶的原因

a.TuqDNA聚合隨失活b.引物出現質量問題c.Mg2+濃度過低d.變性時的溫度低，變性時間短

（2）出現非特異性擴增條帶的主要原因

a.模板DNA出現污染b.引物特異性不強（過短）或形成引物二聚體c.Mg2+濃度過高

d.復性時的溫度過高

附圖：

GATCCTT……目的?CC

~GAA……A因???GqCTAG

3AlycG「??,AATTG

TAGC-i-TTAACCTAG

-AATTG^ATCCTT-HW-CCGATCATCG...

-TTAACCTAGGAA從因??GgCTAjjTAGC-S

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??TTAACCTAGb"MU??…口331)*6＜：…

「看【考點剖析】

考點一：目的基因的篩選與獲取

F例

I.2020年3月16□,中國科學家陳薇院士團隊研制的重組新冠疫苗通過臨床研究注冊審評，獲

批進入臨床試驗。重組新冠疫苗的制備流程如圖。回答下列問題。

(1)步驟②需要作為原料。步驟③需要的工具酶主要是

（2）被用作載體的Ad5應具有的特點是（答出1點即可）。

（3）步驟④是o

（4）重組疫苗注入志愿者體內后，S蛋白基因指導合成的S蛋白作為,刺激機體產生能與之相結合

的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標。參加臨床試驗的志愿者需要滿足的條件

之一是（填“有”或"無"）SARS-CoV-2感染史，理由

是____________________________________________________________________________

（5）為探究疫苗的注射劑量對志愿者產生的免疫效果，需進一步試驗，請寫出試驗思路：

【答案】（1）脫氧核甘酸〃同酶（2）能自我復制（或有一個或多個限制酶切割位點、有標記基因位點、對

受體細胞無害）（3）基因表達載體的構建（4）抗原無有SARS-CoV-2感染史的志愿者皿清中存在一

定量的相應抗體，會對試驗結果產生干擾（5）給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時間后采集

血樣并檢測相應抗體的水平

【解析】（1）步驟②為逆轉錄過程，合成的產物是cDNA,因此需要脫氧核甘酸作為原料。步驟③為利用PCR

技術擴增獲得S蛋白基因的過程，該過程需要的酶是hg酶（耐高溫的DNA聚合酶）。（2）Ad5作為載體應具

有的特點是能自我復制、有多個限制酶切割位點、有標記基因、在宿主細胞中可以存活并表達、對宿主細

胞無害等。（3）步驟④為構建目的基因表達載體的過程，即重組新冠疫苗的過程。（4）重組疫苗注入志愿者體

內后，S蛋白基因指導合成的S蛋白可作為抗原，刺激機體產生特異性免疫過程，使機體免疫系統產生能與

之相結合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標.參加臨床試驗的志愿者需要滿

足無SARS-CoV-2感染史的條件，即未感染過新冠病毒的志愿者，因為感染過新冠病毒的人體內含有相

應的記憶細胞，若注射疫苗，則會出現二次免疫的特征，即體內的記憶細胞會迅速增殖分化，產生大量的

漿細胞，漿細胞合成并分泌大量的抗體，從而導致無法檢測出該疫苗的真正效果。（5）實驗H的為探究疫苗

的注射劑量對志愿者產生的免疫效果，根據實驗目的可知，該實驗的自變量為疫苗的注射劑量，因變量為

抗體產生量，因此設計實驗如F：將同性別且年齡相當的志愿者隨機分成若干組，然后給不同組別的志愿

者注射不同劑量的疫苗，一段時間之后，檢測志愿者體內的抗體產生量，作好記錄并進行比較、分析，從

而得出結論。

考點二：表達載體的構建

、"例2.大腸桿菌p-半乳糖甘酶（Z酶）可催化底物（X-gal）水解產生藍色物質。在pUC18質粒中，/acZ編

碼Z酶氨基端的一個片段（稱為a-肽），該質粒結構及限制酶識別位點如圖甲所示。已知a-肽、缺失a-肽的Z

酶片段單獨存在時均無Z酶活性，共同存在時就會表現出Z酶活性。利用圖乙中的DNA片段與pUC18質

粒進行基因工程操作。

Sal1H/ndinSalI

.1.1.1.

門

1IJ、*—J

目的基因

乙

⑴限制酶能催化雙鏈DNA分子中(填化學鍵名稱)的斷裂。本實驗可使用限制酶處理

pUC18質粒和圖乙中的DNA片段，再通過DNA連接的連接，獲得含目的基因的重組質粒。

(2)用重組質粒轉化大腸桿菌，然后將大腸桿菌接種到含氨葦青霉素的固體培養基上進行培養，由「未發生

轉化的大腸桿菌沒有該質粒，因而不具有，在該培養基上不能生長。從功能上劃分，該培養基屬

于培養基。

(3)當上述培養基中含有X-gal時，生長出的菌落有藍色和白色兩種類型，其中含有重組質粒的大腸桿菌的

菌落顏色為，這是因為___________________________________

為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質粒的大腸桿菌，本實驗作為受體細胞的大腸桿菌中Z酶基因應滿

足的條件是。

【答案】⑴磷酸二酯鍵Sall

(2)氮葦青霉素抗性選擇

(3)白色目的基因與質粒連接后使hcZ'被破壞，不能合成a-肽編碼a-肽的DNA序列缺失，其他序列正

常

【解析】⑴限制酶能催化雙鏈DNA分子中特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，將DNA斷開。從圖中可知，酶

可破壞目的基因，而質粒和目的基因兩側都有隨SHI識別位點，因此本實驗可使用限制酹Sall處

理pUCI8質粒和圖乙中的DNA片段。

(2)重組質粒上有氨年青霉素抗性基因，由于未發生轉化的大腸桿菌沒有該質粒，因而不具有氨節青霉素抗

性，在含氨葦青霉素培養基上不能生長。從功能上劃分，該培養基屬于選擇培養基，選擇了含重組質粒的

大腸桿菌。

(3)從圖中可知，重組質粒是用酶Sa/1分別處理過的質粒和目的基因片段形成的，重組質粒的/acZ基因被

破壞，不能合成P-半乳糖甘酷億能)，不能催化底物(X-gal)水解產生藍色物質，故呈菌落白色,已知a-肽、

缺失a-肽的Z酶片段單獨存在時均無Z酶活性，共同存在時就會表現出Z酶活性，為保證能通過菌落顏色

辨別出含有重組質粒的大腸桿菌，本實驗作為受體細胞的大腸桿菌中Z酶基因應滿足的條件是編碼a-肽的

DNA序列缺失，其他序列正常。

考點三、目的基因導入受體細胞

由例

3.乙烯具有促進果實成熟的作用，ACC氧化施和ACC合成酶是番茄細胞內合成乙烯的兩個關鍵

酷。利用反義基因技術（原理如圖1）,可以抑制這兩個基因的表達，從而使番茄具有耐儲存、宜運輸的優點。

圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成的基因的反義基因表達載體的結構示意圖。

細胞原有基因

（靶基因）

DNA

不能合

靶mRNA~一成基因

反義RNAX7的蛋白

形成互補雙鏈RNA,產物

反義基因不能與核糖體結合或

被RNA醒降解

圖1反義基因技術

復制原點

圖2反義基因表達載體

⑴圖2中的2Ali為特異性啟動子，則2Ali應在番茄的（填器官名稱）中表達。

（2）從番茄成熟果實中提取作為模板，利用反轉錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，對

它們進行拼接構成融合基因并擴增。

⑶合成出的ACC氧化酹基因兩端分別含限制酶反〃用I和X/構I的酶切位點,ACC合成陋基因兩端含Sac1

和XbaI的酶切位點，用限制隨對上述兩個基因進行切割后，再將它們拼接成融合基因，相應的

Ti質粒和融合基因均使用限制酶進行切割，以確保融合基因能夠插入載體中。

（4）為了實現圖1中反義基因的效果，應將融合基因（填“正向”或“反向”）插入啟動子2Ali的下游即

可構成反義融合基因。

⑸在檢測番茄細胞中是否存在反義融合基因時，（虞?能"或"不能"）用放射性物質標記的ACC氧化

（合成）酶基因片段作探針進行檢測，理由

是O

【答案】⑴果實（2）RNA（3）XhaI及〃”HI和Sac【（4）反向（5）不能番茄細胞內本來就存在ACC

氧化（合成）陋基因，能與ACC氧化（合成）睡基因探針發生分子雜交

【解析】（1）番茄食用的是果實，因此，啟動子2Ali應在番茄的果實中表達。（2）從番茄成熟果實中提取RNA

作為模板，利用反轉錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。（3）使用限制酶X/%I對合成出的ACC

氧化酶基因和ACC合成酶基因進行切割后，兩種基因有相同的黏性末端，可將二者拼接形成融合基因。相

應的Ti質粒和融合基因均使用限制酶I和SacI進行切割，然后再連接，可以確保融合基因能夠插

入載體中。（4）為了實現圖1中反義基因的效果，應將融合基因反向插入啟動子2Ali的下游。（5）番茄細胞

內本來就存在ACC氧化（合成）酶基因，能與ACC氧化（合成）醐基因探針發生分子雜交，因此，不能用放射

性物質標記的ACC氧化（合成）陋基因作為探針進行檢測。

四、目的基因的檢測與鑒定

例4.通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細胞中，使之充分表達，再經純化

可制得乙型肝炎疫苗?；卮鹣铝袉栴}：

（1）人體接種乙型肝炎疫苗后，該疫苗可作為刺激機體發生特異性免疫反應。乙型肝炎疫苗先后需

要接種多次，其目的是o

（2）如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，則可以推測出相應目的基因的核甘酸序列，但推測出的

目的基因核甘酸序列并不是唯一的，其原因是。

（3）洛編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因導入酵母菌細胞之前需要構建基因表達載體，這一過程中需要的工

具醉主要有。構建的基因表達載體口，編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因應該

位于之間。

（4）洛編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因導入酵母菌細胞時，使該基因在酵母菌細胞中得以穩定遺傳的關鍵

是o

【答案】（1）抗原使人體產生更多的抗體和記憶細胞（2）決定氨基酸的密碼子具有簡并性（或決定一種家

基酸的密碼子往往不是只有一種）（3）限制酶和DNA連接酶啟動子和終止子（4）確保編碼乙型肝炎病毒

表面抗原的基因插入到酵母菌細胞的染色體DNA上

【解析】（1）乙型肝炎疫苗可作為抗原引起人體產生特異性免疫反應。乙型肝炎疫苗需先后接種多次的目的

是使人體產生更多的抗體和記憶細胞，以發揮最大的免疫效果。（2）由于mRNA上的密碼子具有簡并性，根

據蛋白質的氨基酸序列推測出的mRNA的核甘酸序列不是唯一的，所以推測出的基因的核甘酸序列不是唯

一的。（3）在構建基因表達載體過程中，需要用限制酶切割H的基因片段與載體，再用DNA連接酶把目的基

因與載體連接起來。構建的基因表達載體中，啟動了?和終止子分別是基因表達中轉錄起始和終止的調控序

列，目的基因需要插在啟動子和終止子之間。（4）真核細胞分裂時細胞質DNA隨機分配，應將目的基因插入

到酵母菌細胞的染色體DNA上，以確保目的基因在酵母菌細胞中穩定遺傳。

【真題演練】

I.（2021湖北,16）某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除付的基因條帶（引物與模板完全配

對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中

有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間D.提高復性的溫度

【答案】D

【解析】

【分析】多聚酶鏈式反應（PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，PCR過程一般經歷下述三循環：

952F使模板DNA變性、解鏈-55c下復性（引物與DNA模板鏈結合）一＞72c下引物鏈延伸（形成新的

脫氧核甘酸鏈）。

【詳解】A、增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤：

BC、延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有

效減少反應非特異性條帶，BC錯誤；

D、非特異性產物增加的原因可能是復性溫度過低會造成引物與模板的結合位點增加，故可通過提高復性的

溫度來減少反應非特異性條帶的產生，D正確。

2.（2020北京生物高考題）12.為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉

運蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中（如圖）。

坪界楊樹內源DNA

（注：①、②、③、④表示引物）

為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行PCR

擴增時，應選擇的引物組合是（）

A.①+③B.①+@C.③+②D.③+④

【答案】B

【解析】圖示中克隆的重金屬轉運蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若要檢

測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和

HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①+②，即B正確，ACD錯誤。

3.12021湖北，16）某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全

配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施

中有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延長熱變性的時間

C.延長延伸的時間D.提高復性的溫度

【答案】D

【解析】增加模板DNA的量可以提高反應速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤；延長熱變性的時

間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應非特異性

條帶，BC錯誤：非特異性產物增加的原因可能是復性溫度過低會造成引物與模板的結合位點增加，故可通

過提高復性的溫度來減少反應非特異性條帶的產生，D正確。

4.（2020?北京）為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白（HMA3）

基因與外源高效啟動子連接，導人楊樹基因組中（如圖）.

左邊屈T>右邊界

?M內內?DNA

—Ha動手HHMQ茶因H終止于H—

（注：①、②、③、④表示引物）

為檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因，同時避免內源HMA3基因的干擾，在進行

PCR擴增時，應選擇的引物組合是（）

A.①+③B.①+②C.③+②D.③+④

【答案】B

【解析】圖示中克隆的重金屬轉運蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中，若

要檢測獲得的轉基因楊樹苗中是否含有導入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子

序列和HMA3基因序列，應選擇的引物組合是①+②，即B正確，ACD錯誤。

5.12019?北京）篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養基。接種培養后，若細菌能分解淀粉，培

養平板經稀碘液處理，會出現以菌落為中心的透明圈（如圖），實驗結果見下表。

菌種菌落直徑：C（mm）透明圈直徑：H（mm）H/C

細菌I5.111.22.2

細菌II8.113.01.6

有關本實驗的敘述，錯誤的是（）

A.培養基除淀粉外還含有氮源等其他營養物質

B.篩選分解淀粉的細菌時，菌液應稀釋后涂布

C.以上兩種細菌均不能將淀粉酶分泌至細胞外

D.H/C值反映了兩種細菌分解淀粉能力的差異

【答案】C

【解析】篩選淀粉分解菌的培養基中，除淀粉提供碳源外，還需要氮源、水、無機鹽等營養物質，A正

確；篩選分離淀粉分解菌時需要將菌液進行一定程度的稀釋才能涂布培養，B正確；據圖分析可知，兩

個菌落均產生了透明圈，說明兩種細菌均能將淀粉酶分泌至細胞外，C錯誤；據表分析可知，H/C值越

大，分解淀粉能力越強，該值的大小反映了兩種細菌分解淀粉能力的差異，D正確。

6.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1）,擬將其與質粒（圖

2）重組，再借助農桿菌導入菊花中。下列操作與實驗目的不符的是（）

EroRIEroRI

ICC因|

圖1

A.用限制性核酸內切酶EcoRI和連接酶構建重組質粒

B.用含C基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因導入細胞

C.在培養基中添加卡那霉素，篩選被轉化的菊花細胞

D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上

【答案】C

【解析】據圖分析可知，在目的基因的兩端、啟動子和終止了之間都有限制性核酸內切酶EcoRI的切割

位點，因此可以用限制性核酸內切酶EcoR【切割目的基因和運載體，之后再用DNA連接酶連接形成基

因表達載體，A正確；將目的基因導入到植物細胞，常用農桿菌轉化法，可以將目的基因C導入到農桿

菌的Ti質粒的T-DNA段，之后再用含C基因的農桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因導入細胞中染色

體上的DNA上，B正確；圖2中顯示標記基因是潮霉素抗性基因，應該在培養基中添加潮霉素，篩選被

轉化的農桿菌，C錯誤；要檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子雜交

技術，D正確。

7.（2021?北京）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些國家和地區肆虐，接種疫苜是控制全球

疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多種，其中我國科學家已研發出的腺病毒載體重組新冠病毒疫苗（重

組疫苗）是一種基因工程疫苗，其基本制備步驟是：將新冠病毒的S基因連接到位于載體上的腺病毒基因

組DNA中，重組載體經擴增后轉入特定動物細胞，進而獲得重組腺病毒并制成疫苗。

（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通過得到cDNA,經獲取S基因，悔切后再連接

到載體。

（2）重組疫苗中的S基因應編碼—o

A.病毒與細胞識別的蛋白

B.與病毒核酸結合的蛋白

C.催化病毒核酸復制的酶

D.幫助病毒組裝的蛋白

（3）為保證安全性，制備重組疫苗時刪除了腺病毒的某些基因，使其在人體中無法增殖，但重組疫苗仍然

可以誘發人體產生針對新冠病毒的特異性免疫應答。該疫苗發揮作用的過程是：接種疫苗—-—-—

誘發特異性免疫反應。

（4）重組疫苗只需注射一針即可完成接種。數周后，接種者體內仍然能檢測到重組腺病毒DNA,但其DNA

不會整合到人的基因組中。靖由此推測只需注射一針即可起到免疫保護作用的原因。

【答案】（I）逆轉錄PCR擴增（2）A

（3）（重組腺病毒）進入細胞表達抗原

（4）重組腺病毒DNA在人體細胞中持續表達抗原，反復刺激機體免疫系統

【解析】⑴新冠病毒是RNA病毒，其遺傳物質是RNA,若要得到與其對應的cDNA,則要進行逆轉

錄。用cDNA擴增出目的基因一S基因需要利用PCR擴增技術。

（2）重組疫苗作為抗原需要被人體免疫系統以別，而重組疫苗中的S基因是從新冠病毒中提取的，所以

重組疫苗中的S基因應編碼病毒與細胞都能識別的蛋白，A正確，BCD錯誤。

故選Ao

（3）重組疫苗對人體來說屬于外來異物，即抗原，故人體接種疫苗后，重組腺病毒進入人體細胞，其在

人體細胞內表達出抗原，引發嘰體產生特異性免疫--細胞免疫和體液免疫，因此該疫苗發揮作用的過

程是：接種疫苗-（重組腺病毒）進入細胞T表達抗原T誘發特異性免疫反應。

（4）接種疫苗后，由于長時間內接種者體內仍能檢測到重組腺病毒DNA,而DNA會不斷表達出S蛋

白，S蛋白作為抗原刺激機體，故機體會反復針對抗原產生.特異性免疫應答。

8.[2019?北京）光合作用是地球上最重要的化學反應，發生在高等植物、藻類和光合細菌中。

（1）地球上生命活動所需的能量主要來源于光反應吸收的—.在碳（暗）反應中，RuBP粉化酶（R酶）

催化CO?與RuBP（C5）結合，生成2分子C3.影響該反應的外部因素，除光照條件外還包括—（寫出

兩個）；內部因素包括（寫出兩個）。

（2）R能由8個大亞基蛋白（L）和8個小亞基蛋白（S）組成。高等植物細胞中L由葉綠體基因編碼并在

葉綠體中合成，S由細胞核基因編碼并在—中由核糖體合成后進入葉綠體，在葉綠體的一中與L組裝成

有功能的酶。

（3）研究發現，原核生物藍藻（藍細菌）R酶的活性高于高等植物。有人設想通過基因工程技術將藍藻R

酶的S、L基因轉入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人員將藍藻S、L基因轉入某高等植物（甲）

的葉綠體DNA中，同時去除甲的L基因。轉基因植株能夠存活并生長。檢測結果表明，轉基因植株中的R

能活性高于未轉基因的正常植株.

①由上述實驗能否得出“轉基因植株中有活性的R酶是由藍藻的S、L組裝而成”的推測？請說明理

由。。

②基于上述實驗，下列敘述中能夠體現生物統一性的選項包括—O

a.藍藻與甲都以DNA作為遺傳物質

b.藍藻與甲都以R酶催化CO2的固定

c.藍藻R酶大亞基蛋白可在甲的葉綠體中介成

d.在藍藻與甲的葉肉細胞中R酹組裝的位置不同

【答案】（I）光能溫度、CO?濃度色素含量及種類、睡的含量及活性

（2）細胞質基質基質

（3）①不能，因為轉基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除轉基因植株中R酶由藍藻的L蛋白和甲植

株的S蛋白組成

②a、b、c

【解析】1、光合作用的過程圖解:

2、基因工程技術的基本步驟:

（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記

基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方

法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法：將

目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-

-DNA分子雜交技術：②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術：③檢測目的基因是否翻譯

成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）地球上生命活動所需的能量主要來源于光反應吸收的光能,在碳（暗）反應中，RuBP援化酶（R酶）

催化CO?與RuBP（C5）結合，與成2分子C3.影響該反應的外部因素，除光照條件外還包括溫度、C02

濃度等；內部因素包括色素含量及種類、酶的含量及活性等。

（2）R酶由8個大亞基蛋白（L）和8個小亞基蛋白（S）組成。高等植物細胞中L由葉綠體基因編碼并在

葉綠體中合成，S由細胞核基因編碼并在細胞質基質中由核糖體合成后進入葉綠體，在葉綠體的中與L