ICS

70.080CCS

B

43湖 南 省 地 方 標 準DB43/T

959.2—2023代替

異種移植用無指定病原體（

Free,

DPF）醫用供體豬第Medical

grade

DPF

donor

pig

for

xenotransplantationPart2:mircrobiological

parasitological

standards

and

surveillance2023

-

11

-

09

發布

2024

-

-

實施湖南省市場監督管理局

發

布DB43/T

959.2—2023 前言························································································································

Ⅲ引言························································································································

Ⅴ1

·····················································································································12

規范性引用文件······································································································13

術語和定義············································································································14

微生物學等級·········································································································35

檢測要求···············································································································36

檢測程序···············································································································37

檢測方法···············································································································38

檢測規則···············································································································59

結果判定···············································································································610判定結論··············································································································611 樣本保存··············································································································6附錄

A（規范性）牛分枝桿菌

PCR

檢測方法····································································7附錄

B（規范性） 細胞內鳥型分枝桿菌

PCR

檢測方法························································

8附錄

C（規范性） 新型隱球菌

DNA

實時熒光定量

PCR

··················································9附錄

D（規范性） 抗莢膜組織胞漿菌抗體

ELISA

檢測方法················································

10附錄

E（規范性） 豬蘭氏類圓線蟲病鏡檢法診斷····························································

11附錄

F（規范性） 布氏姜片吸蟲鏡檢法診斷··································································

12附錄

G（規范性） 豬腦心肌炎病毒間接

ELISA

·························································

13附錄

H（規范性） 人流感病毒多重

PCR

檢測··································································

14附錄

I（規范性） 豬巨細胞病毒

·································································

15附錄

J（規范性） 皰疹病毒核酸檢測···········································································

17附錄

K（規范性） 豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐）RT‐PCR

檢測··························

19附錄

L（規范性） 豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）巢式

PCR

檢測·············································

20附錄

M（規范性） 豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測·······························································

21附錄

N（規范性） 豬內源性逆轉錄病毒

C（）

···········································

24附錄

O（規范性） 豬嗜淋巴細胞皰疹病毒

3

型

熒光定量

檢測

····························

25附錄

P（規范性） 新型冠狀病毒肺炎防控方案（第七版）················································

26DB43/T

959.2—2023 本文件按照

GB/T

—《標準化工作導則 第

1

部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件是DB43/T

959《異種移植用無指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫用供體豬》的第2部分。DB43/T

959已發布了以下部分：——第1部分：遺傳質量控制；——第2部分：微生物、寄生蟲學等級與監測；——第3部分：配合飼料；——第4部分：病理學診斷規范；——第5本文件替代DB43/T

959.2—2014《異種移植用無指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫用供體豬

第2DB43/T

959.2—2014外，主要技術變化如下：a）

將本文件“標題”由“異種移植用無指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫用供體豬

第

2

Pathogen

DPF）醫用供體豬

第

2

部分：微生物、寄生蟲學等級與監測”；b）

增加了“引言”一章；c）

1新型冠狀病毒的檢測及檢測方法（見

7，2014

7）；d）

更改了“檢測頻率”（見

，2014

8.1）；e）

2

抽樣數量”（見

8.2.2，2014

8.2.2請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由湖南省科學技術廳提出并歸口。本文件起草單位：中南大學湘雅三醫院，湖南賽諾生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王維、羅敏華、李桑、蔡亮、胡鵬志、馬小倩、徐暢、王佳、石興勇。本文件及其所替代文件的歷次版本發布情況為：——2014年首次發布為

959.2—2014；——本次為第一次修訂。IIIDB43/T

959.2—2023 異種移植用無指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

）醫用供體豬標準化能更好的促進異體系中，DB43/T

《異種移植用無指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫用供體豬》是指導湖南省異種移植用無指定病原體醫用供體豬培育的基礎性和通用性的標準。DB43/T

959旨在確立普遍適用于標準化異種移植用無指定病原體醫用供體豬遺傳質量控制、微生物檢測、飼料、病理學檢測、環境設施的準則，擬由五個部分構成。——第1——第2部分：微生物、寄生蟲學等級與監測。目的在于保證異種移植用無指定病原體醫用供體豬生物安全性。——第3部分：配合飼料。目的在于保障異種移植用無指定病原體醫用供體豬飼料的安全和營養。——第4部分：病理學診斷規范。目的在于標準化異種移植用無指定病原體醫用供體豬病理學檢測內容和方法。——第5部分：環境與設施。目的在于標準化異種移植用無指定病原體醫用供體豬環境條件控制和設施建設。2014生蟲學監測的地方標準。DB43/T

959.2發布實施已九年，這期間國際異種移植領域取得了突破性成果，2018DB43/T

959.2DB43/T

高質量、高安全性異種移植用無指定病原體醫用供體豬的穩定發展。測內容與方法，以保證異種移植用無指定病原體醫用供體豬穩定發展。本次對

959.2

的修訂，高異種移植的成功率，從而全面提升我國異種移植發展水平。DB43/T

959.2—2023Designated

DPF

1

本文件規定了異種移植用無指定病原體（Designed

Pathogen

Free,

DPF）醫用供體豬微生物學等級分類、檢測要求、檢測程序、檢測方法、檢測規則、結果判定、判定結論、樣本保存等。本文件適用于異種移植用

DPF

醫用供體豬微生物學等級監測。2

規范性引用文件文件。GB/T

實驗動物沙門菌檢驗方法GB/T

實驗動物皮膚病原真菌檢測方法GB/T

實驗動物 支原體檢測方法GB/T

14926.27 實驗動物小鼠腺病毒檢驗方法GB/T

14926.30 實驗動物 兔輪狀病毒檢測方法GB/T

14926.46實驗動物 鉤端螺旋體檢測方法GB/T

14926.47 實驗動物 志賀菌檢測方法GB/T

14926.48 實驗動物結合分枝桿菌檢測方法GB/T

14926.56 實驗動物狂犬病病毒檢測方法GB/T

16551 豬瘟診斷技術GB

17013 包蟲病診斷標準及處理原則GB/T

18090豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法GB/T

實驗動物體外寄生蟲檢測方法GB/T

實驗動物 弓形蟲檢測方法GB/T

實驗動物 蠕蟲檢測方法GB/T

18648 非洲豬瘟診斷技術GB/T

18638 流行性乙型腦炎診斷技術GB/T

18641 偽狂犬病診斷技術GB/T

18646 動物布魯氏菌病診斷技術GB/T

18647 動物球蟲病診斷技術GB/T

18935 口蹄疫診斷技術GB/T

19200 豬水泡病診斷技術GB/T

豬鏈球菌

2

型平板和試管凝集試驗操作規程DB43/T

959.2—2023GB/T

豬鏈球菌

2

型分離鑒定操作規程GB/T

豬鏈球菌

2

型

定型檢測技術GB/T

豬鏈球菌

2

型熒光

檢測方法GB/T

21674 豬圓環病毒聚合酶鏈反應試驗方法GB/T

22333 日本乙型腦炎病毒反轉錄聚合酶鏈反應試驗方法GB/T

22915 口蹄疫病毒熒光

檢測方法GB/T

22917 豬水泡病病毒熒光

RT-PCR

檢測方法GB/T

27517 鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經典毒株復合

方法GB/T

27536 豬流感病毒分離與鑒定方法GB/T

21674豬圓環病毒聚合酶鏈反應試驗方法GB/T

34757 豬流行性腹瀉

RT-PCR

檢測方法GB/T

35912 豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光

檢測方法GB/T

36871 豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重

檢測方法NY/T

豬傳染性胸膜肺炎診斷技術NY/T

獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范NY/T

豬痢疾診斷技術NY/T

豬傳染性萎縮性鼻炎診斷技術NY/T

豬傳染性胃腸炎診斷技術NY/T

動物和動物產品沙門氏菌檢測方法NY/T

豬巴氏桿菌病診斷技術NY/T

豬繁殖和呼吸綜合癥免疫酶試驗方法SN/T

0420 出口豬肉旋毛蟲檢驗方法

磁力攪拌集樣消化法SN/T

豬瘟單克隆抗體酶聯免疫吸附試驗SN/T

1396 弓形蟲病檢疫技術規范SN/T

豬傳染性胃腸炎阻斷酶聯免疫吸附試驗SN/T

1699 豬流行性腹瀉檢疫技術規范SN/T

1919豬細小病毒病檢疫技術規范SN/T

2708 豬圓環病毒病檢疫技術規范SN/T

3499 新孢子蟲病檢疫技術規范SN/T

4235 豬戊型肝炎檢疫技術規范SN/T

5124 豬

Delta

冠狀病毒檢疫技術規范3

術語和定義下列術語和定義適用于本文件。異種移植用

DPF

醫用供體豬

grade

DPF

pig

for

經人工飼養與培育，遺傳背景明確或者來源清楚，

月齡體重宜不超過

50kg，不攜帶世界衛生組織（World

Health

Organization，WHO）指定供體動物應排除的潛在感染或條件致病和感染性人畜共患體、科學研究、教學、生產和質量控制鑒定以及其他科學實驗的小型豬。DB43/T

959.2—20234

微生物學等級異種移植用

DPF

醫用供體豬微生物學等級為醫用供體無指定病原體級。5

檢測要求5.1 臨床觀察外觀檢查無異常。5.2 微生物檢測項目異種移植用

DPF

醫用供體豬病原微生物檢測項目見表

1。6

檢測程序檢測程序見圖

1。圖

1 異種移植用

醫用供體豬檢測程序結合臨床癥狀和實驗室檢查結果，需要進一步確證時，可取特定樣本進行檢測。7

檢測方法檢測方法見表

1。類型序號測項測方菌類Bacterium

Brucella

sppGB/T

18646

Leptospira

sppGB/T

14926.46

SerpulinahyodysenteriaeNY/T

545

Mycobacterium

bovis附錄A

Mycobacterium

tuberculosisGB/T

14926.48細胞內鳥型結核分枝桿菌復合物Mycobacterium

avium-intracelluare

complex附錄B

Mycoplasma

hyopneumoniaeGB/T

14926.8

Salmonella

typhiGB/T

14926.1NY/T

550

ShigellaGB/T

14926.4710

Bordetella

bronchisepticaNY/T

546

Pasteurella

multocidaNY/T

546NY/T

56412

Actinobacillus

pleuropneumoniaeNY/T

53713

2

型Streptococcus

suis

type

2GB/T

19915.1-3GB/T

19915.7真菌類Fungi14

Pathogenic

dermal

fungiGB/T

14926.415

Cryptococcus

neoformans附錄C16www.bzfxw.

Histoplasma

capsulatum附錄D生蟲Parasites17

EctozoaGB/T

18448.118

Ascaris

suumGB/T

18448.619

Echinococcus

sp.GB

1701320

Isospora

spGB/T

1864721

Strongyloides

ransomi附錄E22

Toxoplasma

gondiiGB/T

18448.2SN/T

139623

Trichinella

spiralisSN/T

042024

NeosporaSN/T

349925

Fasciolopsis

buski附錄F病毒類26

Adenovirus(porcine)GB/T

14926.2727

Encephalomyocarditis

virus附錄G28

porcine

Influenza

virusGB/T

2753629

Human

Influenza

viruses附錄H30

Porcine

cytomegalovirus附錄I31

Porcine

gama-herpesvirus附錄J32Porcine

reproductiveandrespiratory

syndrome

virusGB/T

27517DB43/T

959.2—2023表

表

1異種移植用

醫用供體豬病原微生物檢測項目及檢測方法類型序號測項測方病毒類33繁殖與呼吸綜合征病經典毒Porcine

reproductive

andrespiratory

syndrome

virusGB/T

3591234

Procine

parvovirusSN/T

191935

RotavirusGB

/T

14926.3036

Pseudorables

virusGB/T

1864137

Rabies

virusGB/T

14926.5638

Foot

and

mouth

disease

virusGB/T

18935GB/T

2291539

Classical

swine

fever

virusGB/T

16551SN/T

1379.140

Japaneses

encephalitis

virusGB/T

18638GB/T

2233341

Porcine

circovirus

type

GB/T

21674

2708422型Porcine

circovirus

type

GB/T

21674

270843傳染性胃腸炎病毒Porcine

transmissible

gastroenteritis

virusGB/T

36871NY/T

548SN/T

1446.144

Porcine

epidemic

diarrhea

virusGB/T

36871GB/T

34757SN/T

169945

Porcine

deltacoronavirusSN/T

512446急性腹瀉綜合征冠狀病毒Swine

acute

diarrhea

syndrome

coronavirus附錄47www.bzfxw.

Porcine

Respiratory

Coronavirus附錄48血凝性腦脊髓炎病毒Porcine

hemagglutinating

encephalomyelitis

virus附錄49

Swine

vesicular

disease

virusGB/T

19200GB/T

2291750內源性逆轉錄病毒Porcine

endogenous

retrovirus

(PERV-C)附錄51

Porcine

lymphotropic

herpesvirus(PLHV)附錄52

Hepatitis

virus

(HEV)SN/T

4235-201553

Severe

Acute

Respiratory

SyndromeCoronavirus

SARS-CoV-2附錄54

Diagnostic

techniques

for

African

swinefeverGB/T

18648DB43/T

959.2—2023表

1表

1異種移植用

醫用供體豬病原微生物檢測項目及檢測方法（續）8.1 檢測頻率每

3

個月至少檢測一次。8.2 抽樣8.2.1 選擇

3

月齡以上的異種移植用

醫用供體豬用于檢測，隨機抽樣。體大小樣數量5050-100100-5001050025100DB43/T

959.2—20238.2.2根據異種移植用

DPF

醫用供體豬群體大小，抽樣數量見表

2。表

2 表

2 抽樣數量 按病毒、細菌、真菌、寄生蟲檢測要求聯合采樣。 采樣方法按照

NY/T

以及醫學采樣程序進行。8.3樣本標識要求達實驗室。9

結果判定

9.1 合格判定

10

判定結論所有項目的檢測結果均合格，判為符合

等級標準。否則，判為不符合

等級標準。11

樣本保存11.1 間為

1

年。11.2 存規范。DB43/T

959.2—2023附

錄 A（規范性）牛分枝桿菌

PCR

檢測方法A.1 原理以牛分枝桿菌

基因和

PCR

方法。A.2 樣品采集A.2.1 樣品類型健康樣本A.2.2 樣品采集用無菌剪刀剪取病料組織約

1.5mL

EP

μL

的組織消化液和蛋白酶

K（終濃度為

l

mg/mL）；55℃，水浴

8h，其間間隔半小時顛倒

EP

管幾次，以使病料組織與消化液充分反應；，離心

5min，取上清液置另一無菌

1.5mL

EP

管中；加入等體積的苯酚：：24：ll2000rpm

EP

1

℃

30min；

10min，棄上清；沉淀用

70％乙醇清洗，并置

37℃，至乙醇揮發完全；加入

30μLTE，并加入

37℃，放置

40min；將所得液體作為模板，并置-20℃保存。A.3 操作步驟A.3.1引物的設計參照

Mycobacterium

bovis

AF2122/97

基因序列設計出

基因和

IS6110

基因引物。引物序列如下：16SrRNA

P1:5’-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-16SrRNA

P2:5’-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3’

擴增片段大小約為

584bp。IS6110P1:5’3’

IS6110P2:5’-TTTGTCACCGACGCCTACGCT-3’

擴增片段大小約為

。A.3.2

L2μ

（1.75pg-1.75μg），L10×

buffer

2.5μL，dNTPs

2μL，IS6110

引物各

0.5μL（5pM

引物各

μL（15pM蒸餾水

14μL，Taq

酶

μL（2.5U）；體系總體積為

25μL。PCR

擴增的反應條件：95℃預變性

10min，℃變性

，59.5℃退火

30s，72℃延伸

，30

環，最后延伸

7min，4℃保存。A.3.3

0.8％的瓊脂糖，電壓

，電泳

12-15min，在凝膠成像系統中檢測。A.4 結果判定按照設定的雙重309bp的IS6110基因和約584bp的

16SrRNA

基因的目的片段說明

PCR

結果陽性。DB43/T

959.2—2023附

錄 B（規范性）細胞內鳥型分枝桿菌

PCR

檢測方法B.1 以鳥型分枝桿菌特異性插入序列

IS1245分枝桿菌。B.2樣品采集B.2.1 樣品類型豬皮膚組織B.2.2 樣品采集無菌條件下取上述組織

左右，置入

1.5mL

管。B.3 操作步驟B.3.1 組織處理

2mL上清液，2

倍連續稀釋后裝于微量離心管中。B.3.2

擴增和檢測擴增插入序列

：引物

1

為

5’

ACGATCTAC-3’引物

2

為

5’’50μL

PCR

反應體系含

10×PCR

緩沖液

5μL，25mmol/L

MgCl2

5μL，dNTPs

μmol/L，引物各1μmol/L，模板

DNA10μL，TaqDNA

聚合酶

1U。循環條件：94℃預變性

5min，其后按

94℃

30s，65℃30s，℃

45s，擴增產物于

1.5％瓊脂糖凝膠電泳，花青素染色，用紫外檢測儀觀察結果并攝影。B.4 結果判定。出現

427bp

擴增帶為陽性，未見

427bp

擴增帶為陰性。DB43/T

959.2—2023附

錄 C（規范性）新型隱球菌

DNA

實時熒光定量

C.1 以新型隱球菌的

基因序列中一段高度保守序列為目的序列，設計出特異引物和探針，應用實時熒光定量

PCR

技術進行檢測。C.2 樣品采集C.2.1 樣品類型豬肺部分泌物C.2.2 樣品采集

取上清，加入雙抗保存備用。C.3操作步驟C.3.1引物的設計根據新型隱球菌的基因序列設計引物為：FP:5’-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-RP:5’-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3’C.3.2

的提取取氣管分泌物上清加入

和蛋白酶

K，50℃水浴

分鐘搖一次。用酚及酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用

20ul

無菌雙蒸水溶解備用。在反應體系中加入

5ul

模板，總量為

50uL。C.3.3 目的基因的擴增以

50μL

PCR

反應體系進行反應：10×PCR

Buffer（含

15mmol/L

MgCl2）5μL，dNTP

mixture（10μmol/L）1μL，Taq

5U/μL）μL、DNA

2μL

3μL

dd

H2O至

50μL，于擴增儀擴增，循環條件：94℃

5min，94℃

、58℃

1min

共

個循環。C.4 結果判定取

5μLPCR

產物于

％瓊脂糖（含

10％

）中，5V/cm

電壓電泳

60-75min，紫外透視儀上檢測，熒光條帶在

處即為陽性。DB43/T

959.2—2023附

錄 D（規范性）抗莢膜組織胞漿菌抗體

檢測方法D.1 用中

國

藥

品

生物

制

品

檢定

所

研

制

的莢

膜

組

織胞漿

菌

蛋

白

提取

物

（purified

protein

fromHistoplasma

capsulatum，P-HTPM吸附試驗。D.2 樣品采集D.2.1 樣品類型豬血清D.2.2 樣品采集無菌條件下用一次性注射器取耳靜脈血

，置于試管中，分離血清，待檢。D.3 操作步驟D.3.1 用

1μ孔的抗原包被酶標板，50μL/孔，℃孵育

2h。D.3.2 棄去孔中液體，加入洗滌液（含

0.05％

Tween-20

的

0.01mol/L

pH7.4

PBS、PBST），300μL/孔，洗滌

3

次，每次

3min。D.3.3 扣干。D.3.4 加入封閉液（含

5％犢牛血清的

PBST），μL/孔，℃封閉

30min。D.3.5

），100μ/37℃作用

30min。D.3.6

3

次（方法同前）。D.3.7 扣干。D.3.8

的酶標抗體（二抗）100μL/37

45min。D.3.9

3

次。D.3.10 扣干。D.3.11 加入底物

顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色

10-15min。D.3.12 每孔加入

μL

2mol/L

H24終止反應。D.3.13 測定吸光度值，按照下列公式計算

P/N

值=陽性對照孔

OD

均值/陰性對照孔

OD

D.4 結果判定當被檢樣品的

A

值＞0.135

時，判定為陽性；當樣品的

A

0.059-0.135

之間時，判定為可疑；當樣品的

A

值＜0.059

時，判定為陰性。10DB43/T

959.2—2023附

錄 E（規范性）豬蘭氏類圓線蟲病鏡檢法診斷E.1 消化道蠕蟲糞學檢查E.2 樣品采集E.2.1 樣品類型豬糞便E.2.2 樣品采集從豬舍地面及豬直腸分別采集豬的糞樣。E.3 操作步驟E.3.1 飽和食鹽水漂浮法檢查取糞樣

10g

溶于飽和食鹽水中，用玻璃棒攪拌均勻后用

目的金屬篩反復過濾，除去大的糞渣，將濾液置于大試管中，讓液面突出于試管口，靜止

30min

后蘸取液面制壓片，在

倍顯微鏡下檢查。E.3.2 尼龍篩淘洗法檢查取糞樣

25

g

置于大燒杯中，用常水溶解并用玻璃棒充分攪拌均勻后，經金屬篩反復過濾，除去大

260

積物制壓片，在

10

倍和

倍顯微鏡下檢查。E.4 結果判定E.4.1 飽和食鹽水漂浮法殼薄，大小為（42-53m×（24-32）μm，內有幼蟲。鑒定為蘭氏類圓線蟲卵。E.4.2 經尼龍篩淘洗法對豬的糞便進行檢查，從地面采集的糞樣中查到蟲體，蟲體細小，呈乳白色，毛發狀，鏡下透明，）mm）mm蟲的桿型幼蟲。11DB43/T

959.2—2023附

錄 F（規范性）布氏姜片吸蟲鏡檢法診斷F.1 消化道蠕蟲糞學檢查F.2 樣品采集F.2.1 樣品類型豬新鮮糞便F.2.2 樣品采集從豬舍地面及豬直腸分別采集豬的糞樣。F.3 操作步驟F.3.1直接涂片法先取

滴蒸餾水（或

％的甘油水）于載玻片上，再用火柴棒取新鮮的糞便混合均勻，去除污穢后，用低倍鏡檢查。F.3.2 沉淀法取

g

的糞便于燒杯中加

20

mL

水，用篩過濾后，裝入離心器然后倒上清液，再進行離心，反復數次，取沉淀渣滴于玻片上，用低倍鏡檢查。F.4 結果判定看出，長寬比約為

μm×85-97μm，鑒定為布氏姜片吸蟲陽性。12DB43/T

959.2—2023附

錄 G（規范性）豬腦心肌炎病毒間接

檢測G.1 由于

2C

白并刺激機體產生抗體，通過重組

蛋白為包被抗原建立檢測豬腦心肌炎病毒抗體間接

ELISA

方法。G.2 樣品采集G.2.1 樣品類型豬血清G.2.2 樣品采集無菌條件下用一次性注射器取耳靜脈血

，置于試管中，分離血清，待檢。G.3操作步驟G.3.1將重組蛋白

2C

0.05mol/L、

100μL/孔包被酶標板，37

1h

后

4℃過夜。G.3.2 棄去孔中液體，加入洗滌液（含

0.05％

Tween-20

的

0.01mol/L

pH7.4

PBS、PBST），300μL/孔，洗滌

3

次，每次

3min。G.3.3 扣干。G.3.4 加入封閉液（含

5％犢牛血清的

PBST），μL/孔，℃封閉

1h。G.3.5 棄去封閉液，加入待檢血清（一抗），100μL/孔，37

45min。G.3.6

3

次（方法同前）。G.3.7 扣干。G.3.8 加入適當稀釋的酶標抗體（二抗）100μL/37

45min。G.3.9

3

次。G.3.10 扣干。G.3.11 加入底物

顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色

10-15min。G.3.12 每孔加入

μL

2mol/L

H24終止反應。G.3.13

OD450

nm

光吸收值，按照下列公式計算

P/N

值：P/N

值=陽性對照孔

/陰性對照孔OD

均值。G.4 結果判定當被檢樣品的

0.27

時，判定為陽性；當樣品的

0.27

時，判定為陰性。13DB43/T

959.2—2023附

錄 H（規范性）人流感病毒多重

PCR

檢測H.1 根據流感病毒

HA

基因和

M

基因設計引物，進行

RT-PCR

方法檢測。H.2 樣品采集H.2.1 樣品類型鼻咽拭子H.2.2 樣品采集標本采集后，冷凍

12

h

內運送至實驗室，24

h

內進行流感病毒分離培養和快速檢測試驗。H.3 操作步驟H.3.1

引物設計分別設計擴增引物擴增HA 全基因片段：H1F--agcaaaagcaggggaaaata-3’H1R--aacaagggtgtttttcctca-3’H3F-3’H3R-3’BF-5’-gggacatgaacaacaaagatgc-3’BR-5’-tgtcagctattatggagctg-H1、

431bp、210bp

和

390bp。H.3.2

提取病毒

模板，用于反轉錄試驗或置-20℃保存備用。H.3.3病毒逆轉錄用試劑盒進行病毒

逆轉錄。H.3.4

反應體系

25μL

×Buffer

2.5μL、MgCl2（25mM）2μL、dNTP

2μL、Taq（μL）μL、H

對引物（10mM

1.25μL、逆轉錄生成的

cDNA

4μL、加水到

25μL。反應程序：94℃

3min，℃

、51℃1min、68℃1min

共

35

個循環，℃10min。H.3.5

產物的鑒定取

PCR

5μL

1％瓊脂糖凝膠電泳。H.4 結果判定出現

431bp、210bp

或

條帶，判定為陽性。14DB43/T

959.2—2023附

錄 I（規范性）豬巨細胞病毒

I.1 原理TaqMan

技術，是利用

Taq

3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，因此從熒光信號的強弱就可以判斷模板數量。I.2 樣品采集I.2.1樣品類型病變組織I.2.2 樣品采集無菌條件下取上述組織

1

g

左右，置入

EP

I.3 操作步驟I.3.1 總

RNA

提取

1.5

1mLTrizol

5min

或馬上℃保存，12000rpm離心

15min

200ul

30s

3-5min分層，12000rpm

，取上清液至新

管，中間層和紅色下層

4℃保存，便于提取

DNA

和

0.5

15min，12000rpm

10min，棄上清，

沉淀管底，如沉淀不明顯，則再離心數秒吸出上清，加入

1

mL

75％乙醇（預冷），溫和震蕩懸浮沉淀，8000rpm

離心

5min，棄上清，短暫快速離心（5s），棄上清，室溫放置

2min

晾干，沉淀加入

15μL

DEPC

處理水，輕彈管壁溶解，少量樣品

55-60℃水浴孵育

10-15min

OD260/280

值后，樣品放置℃保存。I.3.2 反轉錄0.2mL

1μL

總

RNA，1μL

隨機引物

oligo（dt10μL

DEPC

處理水，混勻，瞬時離心

5s，70℃水浴

5min

2min，瞬時離心，加入

4μL

5×Buffer，2μL

0.1M

DTT，2μL

10MmdNTPs，混勻，溫浴

2min，加入

1μL

反轉錄酶，42℃溫育

50min，70℃孵育

10min

滅活，℃冰箱保存。I.3.3 引物與

TapMan

探針的設計與合成設計一對特異引物

P1/P2

和

TapMan

探針：P1:5’-TGGCACTGATACTTGACAAGC-3’P2:5’-CTCCCGTGAAGCCGTAAA-3’TapMan

:

FAM-5’’-TAMRA。I.3.4 標準曲線的建立用含

重組質粒的溶液作標準品，

倍稀釋成

×1010

-1.0×

拷貝/μL，共

1115DB43/T

959.2—2023個稀釋度，以不同濃度的重組質粒為模板進行

敏感性試驗。以起始模板數的對數為

X

軸，以FQ-PCR

循環次數

Ct

值為

Y

軸作回歸曲線，建立

檢測的標準曲線。I.3.5 FQ-PCR

反應條件采用

5μmol/L

的引物濃度和

2.5μmol/L

的探針濃度對質粒標準品進行檢測，雙溫循環及

60退火溫度為最佳的循環條件。

反應總體積為

25μL，其中

10×ExTaq

μL（Mg2+濃度為

2.0mmol/LdNTPs

2μL

ExTaq

酶

0.25μL，上下游引物各

0.5ul（10μmol/L），探針

0.25μL（10μmol/L），模板

1μL，dd

H2O

18.00μL，混合均勻，置熒光定量

PCR

儀上進行自動化擴增反應。反應程序為：94℃預變性

4min，94℃變性

15s，60℃退火延伸

，40

FAM/TAMRA雙標記模式。I.3.6 根據所得曲線作數據分析。I.3.7 取部分

PCR

產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測產物的特異性。I.4 結果判定以電泳陰性對照為標準，根據電泳結果判斷是否有陽性產物。16DB43/T

959.2—2023附

錄 J（規范性）皰疹病毒核酸檢測J.1 原理PHV

DNA

DNA聚合酶（

酶）作用下，配以

SD-Buffer（內含

Mg2+、

等）、四種核苷酸單體（dNTPs成分，通過聚合酶鏈式反應體外擴增法對豬皰疹病毒進行體外擴增，產物經凝膠電泳，

染色，紫外燈觀察，從而達到快速檢測之目的。J.2 標本采集J.2.1 樣本類型血清或病毒液J.2.2 樣本采集發病豬腦、淋巴結、扁桃體、腎和脾等組織標本：無菌條件下取上述組織

1

g

1.5

mL潔凈

管，立即送檢。血清：用一次性無菌注射器抽取受檢豬耳靜脈或者前腔靜脈靜脈血

mL，靜置斜放待血清析出，10000rpm

3min

μL無菌

EP

管，保存待檢。J.3 操作步驟J.3.1 引物設計設計引物序列PHV-F:5’PHV-R:5’-CTTGGTGATCAGCAGCAGCTTG-3’J.3.2

血清或病毒液，常規市售

DNA

提取試劑盒提取

DNA，取提取液進行

擴增。J.3.3

反應總體積為

μL，其中

10×Buffer

2.5μL（Mg2+濃度為

2.0mmol/LdNTPs

2μ

酶0.25μL，上下游引物各

μL（10μmol/L

模板

1μL，dd

H2O

19.00μL，混合均勻，置熒光定量

儀上進行自動化擴增反應。按照下列條件擴增：循環條件：95℃預變性

3min，53℃退火

45s，72℃延伸

3min，共

個循環。J.3.4 電泳檢測J.3.4.1 2凝膠配制：稀釋

50×TAE

至

1×TAE，稱

4

g

瓊脂糖放于

500

mL

錐形瓶中，1×TAE

200

mL，置入微波爐中加熱溶解，再加入

20μL

充分混勻。在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后使用。17DB43/T

959.2—2023J.3.4.2

PCR

擴增產物

15μL

5V/cm

1×TAE

中電泳，紫外燈下觀察結果。J.4 檢測結果判定

242bp

疹病毒陽性，否則為陰性。18DB43/T

959.2—2023附

錄 K（規范性）豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐CoV）RT‐

檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐CoV）RT‐

檢測K.1 原理依據該病毒的保守

N

基因設計特異性引物，優化反應條件，建立

檢測方法。K.2 樣品采集K.2.1 樣品類型糞便K.2.2 樣品采集標本采集后，在-80℃下保存，運送至實驗室，進行豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒核酸提取。K.3 操作步驟K.3.1 在樣品中加入磷酸鹽緩沖液（）（20％），冷凍并解凍三次，然后在

10,000

g

下離心10

分鐘。按照病毒核酸試劑盒說明書進行病毒核酸提取。-80℃保存備用。K.3.2 根據豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒

N

基因序列設計引物：FGGTCCCTGTGACCGAAGTTTTAG；RGCGTTCTGCGATAAAGCTTAAAACTATTA。K.3.3 參照一步法

RT‐

試劑盒說明書進行

RT‐PCR

℃

30

94℃

3

分鐘，94℃變性

35

個循環，55℃退火

72℃延伸

秒，最后

72℃5

分鐘。K.3.4

PCR

產物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測產物的特異性。K.4 結果判定以電泳陰性對照為標準，根據電泳結果判斷是否有陽性產物。19DB43/T

959.2—2023附

錄 L（規范性）豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）巢式

PCR

檢測L.1 原理巢式

是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）

引物擴增完整的片段。第一對

引物擴增片段和普通

PCR

第二次

PCR

PCR

次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式

的擴增非常特異。L.2 樣品采集L.2.1 樣品類型糞便或鼻拭子L.2.2 樣品采集/糞便樣本保存于-80℃，鼻拭子樣本進行冷凍處理后，快速轉運至實驗室，進行相關檢測。L.3 操作步驟L.3.1

RNA

提取試劑盒說明書對糞便或鼻拭子樣本進行

RNA

提取。： ：：L.3.2

PERV

： ：：

；巢式

，

。L.3.3

ISU-1（PRCVMEM-E

或

PRCV

陰性糞便或鼻拭子。L.3.4第一次反應體系：將檢測樣品、陽性和陰性對照的

5μL

RNA、5μL

PCR

緩沖液、5μL

25

mMMgCl2、1μL

10

mM

20

U

Rnasin、5U

逆轉錄酶、2.5

U

0.5μL

的引物

F1

和

R1

混合均勻。在

℃孵育

分鐘，℃

5

分鐘。L.3.5 第一次反應條件：94℃，1

分鐘；1.5

分鐘；72

分鐘，

個循環，10

分鐘。L.3.6

產物以

1:10

稀釋并用作巢式

的模板。取

1μL

5μL

10×

緩沖液、5μL

25

MgCl2、1μL

2.5

U

聚合酶（美國威斯康星州普羅米加市麥迪遜）和各

0.5μL

50

pm

引物

F2

和

R2

混合。L.3.7 1

L.3.81.5％瓊脂糖凝膠上分析PCR產物。PRCV193–253

bp。L.4 結果判定以電泳陰性對照為標準，根據電泳結果判斷是否有陽性產物。20序列（5’3’）CCAGGATAAATTTCTGTGGAACCAGGACTAACCTTTGCTaqMan

DB43/T

959.2—2023附

錄M（規范性）豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測M.1 原理根據

PHEV

S

基因序列設計引物和探針，探針在

5’端標記

FAM

熒光素作為報告熒光基團，3’端標記

TAMRA

熒光基團發出的熒光信號被淬滅基團所吸收，儀器檢測不到熒光信號；而反應進行到延伸階段時，酶發揮

5’→3’的外切核酸酶功能，將探針降解。探針上的熒光基團游離出來，所發出的熒光不再為

PCR

反應的循環往復，

相應增長。M.2樣品采集M.2.1 樣品類型豬的腦、脊髓M.2.2 樣品采集/

2℃?8

℃條件下保存應不超過

24

h，若長期保存應置于

-70℃

超低溫冰箱中，且避免反復凍融。M.3 引物和探針序列信息引物和探針序列信息見表

1。表

M.1 表

M.1 引物和探針序列信息見M.4.1

稱取

g

待檢樣品于組織勻漿儀中，加入

mL

TRIzol

裂解液勻漿，使用微量移液器吸取至1.5

mL

無

RNase

離心管。另取

2

支

無

離心管，分別加入陽性對照樣品、陰性對照樣品。向離心管中分別加入

1

mL

TRIzol

裂解液，劇烈振蕩

15

s，室溫靜置

min。采用其他等效的

提取方法，按照試劑盒說明書進行。加入

μL

預冷氯仿，振蕩

s，冰上靜置

10

。21RNA1.0

OligodT18

μmol/L）1.0

5×MLV緩沖液4.0

dNTP

4.0

RNase

U/μL）0.5

M-MLV

U/μL）0.5

RNase

2

20.0

10×PCR緩沖液2.0

dNTP

2.0

10

1.0

10

1.0

TaqMan10

1.0

cDNA4.0-40.0

ngTaq

0.5

DB43/T

959.2—20234℃高速冷凍離心機

12

r/min

。使用微量移液器吸取上層無色水相于新的

1.5

mL

無

RNase

離心管中。加入等體積預冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃

，靜置

。4℃高速冷凍離心機

12

r/min

，棄上清。加入

1

mL

預冷的

75％乙醇，4

℃

條件下，高速冷凍離心機

12000

r/min

5

。重復上一步操作一次。棄上清，濾紙吸干殘余液體，室溫干燥

2

min。加入

20

μL

無

RNase

H2O

溶解，超微量紫外分光光度計測定核酸濃度。冰浴保存備用。4℃冰箱保存不超過

8

h，長期保存應置于

℃

冰箱。M.4.2 cDNA

模板制備按表

2

中各組分依次加入

PCR

3

s，℃

水浴鍋中水浴

1

h；℃水浴鍋中水浴

2

，-20

℃

冰箱保存備用。表

M.2 表

M.2 反轉錄系配制表設定

PCR

n+23

n

1管，每個樣品設置

3

次重復反應。按表

3

中各組分依次加入

反應管，蓋緊管蓋后，500

r/min

瞬時離心

30

s。表

表

M.3

反應體系配制表DB43/T

959.2—2023M.4.4 反應參數將離心后的

PCR

反應管放入實時熒光定量

PCR

TaqMan

熒光定量

PCR

PHEV

核酸的反應參數：——第一階段，預讀

50℃

2

min；——第二階段，預變性

℃

3

；——第三階段，95℃

s、

℃

s，

60℃

30

s

時進行。M.5 結果判定M.5.1結果分析條件設定根據收集的

Ct

性對照樣品擴增曲線的最高點為準。M.5.2 質控標準M.5.2.1 陰性對照無

Ct

值并且無擴增曲線。M.5.2.2 陽性對照

Ct

30，并出現典型的擴增曲線。M.5.2.3 如陰性對照和陽性對照不滿足以上條件，此次試驗視為無效。M.5.3 結果描述及判定M.5.3.1 陰性判定無

Ct

值并且無擴增曲線，表明樣品中無

PHEV

核酸，判定為陰性。M.5.3.2 陽性判定Ct

值

≤35，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中存在

PHEV

核酸，判定為陽性。M.5.3.3 有效原則M. Ct

值＞35，且出現典型擴增曲線的樣品，建議復檢。M. 若復檢結果仍出現典型擴增曲線，判定為陽性。若無典型擴增曲線，判定為陰性。23DB43/T

959.2—2023附

錄 N（規范性）豬內源性逆轉錄病毒

C（PERV-C）

N.1 原理依據已公布的豬內源性逆轉錄病毒

基因差異，分別設計

、、PERV-C

3

種特異性引物，優化反應條件，建立

PCR

檢測方法。N.2 樣品采集N.2.1 樣品類型血液樣本N.2.2 樣品采集/無菌條件下取上述樣本

PBS

豬

PBMC，℃保存備用。N.3操作步驟N.3.1 提取和總RNA提取：去懸液加入等體積細胞裂解液及20

mg/mL蛋白酶K10ul，消化，按照

DNA/RNA

提取試劑盒說明書進行

、

.N.3.2 3、、

3

種分型；（：；）（：；）；（：；R-A